PTEN抑制對缺血性卒中小鼠軸突再生和功能康復(fù)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、缺血性卒中是成年人致殘的首要病因，迄今缺乏有效的治療手段。目前大量研究主要集中于急性期神經(jīng)損傷和保護(hù)機(jī)制，但急性期神經(jīng)保護(hù)促進(jìn)患者功能康復(fù)的效果不顯著，故有必要探索新的神經(jīng)修復(fù)策略。卒中后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)軸突再生有助于功能康復(fù)，但成年哺乳動(dòng)物CNS軸突再生能力非常有限。一般認(rèn)為，CNS微環(huán)境中的外源性抑制因子是阻礙軸突再生的關(guān)鍵因素。但阻斷外源性抑制因子僅可導(dǎo)致有限的軸突再生，這表明CNS神經(jīng)元還存在內(nèi)源性軸突再生抑制機(jī)制。

2、r>　　 PTEN是近年來新確定的唯一具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，是p53后時(shí)代最重要的抑癌基因。PTEN定位于常染色體10q23.3，具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。PTEN主要通過P13K/AKT、FAK、MAPK三條信號通路發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)化。最近有研究利用中樞視神經(jīng)損傷模型發(fā)現(xiàn)，PTEN介導(dǎo)的對mTOR的活性抑制是影響中樞視神經(jīng)損傷后軸突再生的關(guān)鍵性內(nèi)源抑制機(jī)制。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血急性期通過藥理

3、學(xué)及基因干擾技術(shù)抑制PTEN可以減輕梗死體積和神經(jīng)元凋亡，并證實(shí)是通過激活A(yù)KT/mTOR/S6通路產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。而PTEN信號途徑是否是缺血性腦卒中CNS軸突再生的內(nèi)源抑制機(jī)制?抑制PTEN能否促進(jìn)缺血性卒中后的功能恢復(fù)尚未見比較系統(tǒng)的報(bào)道。
　　 根據(jù)以上思路，本課題旨在研究PTEN抑制對缺血性卒中后CNS軸突再生和功能康復(fù)的影響及其下游分子機(jī)制。首先建立小鼠腦缺血再灌注模型，采用行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方法，觀

4、察缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)PTEN蛋白的表達(dá)，以及PTEN抑制對腦缺血再灌注損傷小鼠CNS軸突再生及功能康復(fù)情況，明確PTEN信號通路是否是腦缺血后CNS軸突再生的內(nèi)源性抑制機(jī)制。其次在小鼠腦缺血再灌注模型基礎(chǔ)上，觀察PTEN抑制后腦缺血邊緣區(qū)的AKT和S6蛋白活化程度；并建立小鼠原代皮層神經(jīng)元缺糖缺氧模型，采用細(xì)胞免疫染色技術(shù)，觀察PTEN抑制對缺氧缺糖損傷神經(jīng)元突起生長的影響，明確PTEN抑制影響缺血性卒中后CNS軸突再生的下游分子機(jī)

5、制。
　　 第一部分，PTEN抑制劑bpv對腦缺血再灌注損傷小鼠軸突再生和功能康復(fù)的影響
　　 目的：研究PTEN抑制劑bpv對腦缺血再灌注損傷小鼠軸突再生和功能康復(fù)的影響，探討PTEN信號途徑是否是缺血性卒中后CNS軸突再生的內(nèi)源性抑制機(jī)制。
　　 方法：首先根據(jù)改良的Zea-Longa線栓法制作小鼠MCAO再灌注損傷模型，動(dòng)物分為5個(gè)組：假手術(shù)組(Sham)；腦缺血再灌注1d、3d、7d、14d組。分別從缺血

6、邊緣區(qū)及對側(cè)相對應(yīng)的大腦皮層和紋狀體提取腦組織蛋白，用Western-blot技術(shù)檢測各時(shí)間點(diǎn)p-PTEN、PTEN蛋白表達(dá)。其次動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組；MCAO+生理鹽水(Saline)組；MCAO+bpv處理組。bpv處理組于缺血再灌注24h后開始腹腔注射bpv溶液，0.2mg/kg/日，至再灌注14d；Sham組和Saline組注射同樣劑量的生理鹽水。缺血再灌注96h后用TTC染色比較動(dòng)物腦梗死體積；觀察腦缺血再灌注14d后小

7、鼠死亡率以及皮質(zhì)寬度指數(shù)；于缺血再灌注1d、3d、5d、7d、9d、11d、14d時(shí)分別采用神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分(NSS)和前肢放置試驗(yàn)評估小鼠神經(jīng)功能變化；用BielschowskySilve染色法檢測腦缺血邊緣區(qū)白質(zhì)束內(nèi)的軸突分布，免疫組織化學(xué)染色檢測缺血邊緣區(qū)腦髓鞘堿性蛋白(MBP)和生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)表達(dá)。
　　 結(jié)果：小鼠腦缺血再灌注1-14d內(nèi)，缺血側(cè)及對側(cè)相對應(yīng)的皮層和紋狀體區(qū)的總PTEN蛋白均呈持

8、續(xù)性高水平表達(dá)，與Sham組相比無明顯差異；其p-PTEN蛋白(非活化)水平與Sham組p-PTEN表達(dá)水平相比亦無明顯差異；p-PTEN/總PTEN比值與Sham組相比均無明顯差異(P>0.05)。缺血再灌注96h后Sham組小鼠未見梗死區(qū)域，bpv處理組腦梗死體積為18.65％?1.54％，與Saline組梗死體積(為18.75％?1.69％)相比無明顯差異(P>0.05)。再灌注14d后，bpv組小鼠死亡率為28.57％，顯著低于

9、Saline組(死亡率為52.38％)(P<0.05)。各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評分比較，bpv處理組11d時(shí)NSS評分為4.33？1.07對Saline組5.83？1.7(P<0.05)，14d為3.58？0.9對Saline組5.33？1.37(P<0.01)；bpv處理組前肢放置試驗(yàn)評分11d為0.58？0.51對Saline組1.17？0.57(P<0.05)，14d為0.50？0.52對Saline組1.17？0.57(P<0.01)

10、。再灌注14d后bpv處理組腦皮質(zhì)寬度指數(shù)為0.68？0.13對Saline組0.56？0.14(P<0.05)，BielSChowskySilver染色的陽性區(qū)域面積bpv處理組為35.41％?2.08％對Saline組24.77％?4.31％(P<0.001)，缺血邊緣區(qū)MBP蛋白陽性區(qū)域面積bpv處理組為32.10％?4.53％對Saline組27.01％?4.79％(P<0.05)，GAP-43陽性細(xì)胞數(shù)bpv處理組為51.77

11、？6.75對Saline組34.35？4.06(P<0.001)。
　　 結(jié)論：1、活化的PTEN可能是腦缺血后抑制軸突再生的內(nèi)源性因子。
　　 2、PTEN信號途徑可能是腦缺血后軸突再生的重要內(nèi)源性抑制機(jī)制。
　　 3、抑制PTEN可顯著降低腦缺血再灌注損傷小鼠的死亡率，促進(jìn)中樞神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)功能康復(fù)。排除bpv通過降低腦梗死體積而促進(jìn)小鼠功能恢復(fù)的可能性。
　　 第二部分，PTEN抑制促進(jìn)缺血性卒

12、中后CNS軸突再生的下游分子機(jī)制研究
　　 目的：研究PTEN抑制劑bpv是否在腑缺血后上調(diào)AKT和mTOR活性，以及PTEN抑制在體外缺血模型中對原代皮層神經(jīng)元突起生長的作用，探討PTEN抑制促進(jìn)缺血性卒中后CNS軸突再生的下游分子機(jī)制。
　　 方法：小鼠腦缺血再灌注24h后開始腹腔注射bpv溶液，0.2mg/kg/口，于再灌注96h后從bpv處理組和Saline組缺血邊緣區(qū)的皮層、紋狀體及對側(cè)相對應(yīng)區(qū)域提取腦組織蛋白

13、，用Western-blot技術(shù)檢測AKT、p-AKT、S6、p-S6蛋白表達(dá)。從小鼠胚胎分離、培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)7d后，對神經(jīng)元進(jìn)行1h缺氧缺糖(OGD)處理，隨后分成5組：200nMbpv處理組；100nMbpv處理組；50nMbpv處理組；20nMbpv處理組；2祃生理鹽水組，放入CO2培養(yǎng)箱，復(fù)糖復(fù)氧24h，使用TUJ1抗體行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，通過熒光顯微鏡觀察測量神經(jīng)元突起長度，確定bpv促進(jìn)神經(jīng)元OGD后突起生長的劑量

14、。確定bpv劑量后，對神經(jīng)元進(jìn)行OGD處理1h，隨后分成4組：bpv+mTOR抑制劑(rapamycin，100nM)組；bpv+AKT抑制劑(LY294002，10μM)；bpv+DMSO組；生理鹽水組，放入CO2培養(yǎng)箱，復(fù)糖復(fù)氧24h，使用TUJ1抗體行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，通過熒光顯微鏡觀察測量神經(jīng)元突起長度，確定PTEN抑制促進(jìn)缺血性卒中后CNS軸突再生的下游分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：與Saline組相比，bpv處理組顯著提高

15、缺血再灌注96h后缺血邊緣區(qū)皮層和紋狀體的AKT和S6蛋白活化水平(P<0.001)。神經(jīng)元OGD/復(fù)糖復(fù)氧24h后，100nMbpv處理組神經(jīng)元突起長度為200.51?35.98um，顯著高于其它4組(P<0.001)。神經(jīng)元OGD/復(fù)糖復(fù)氧后bpv+DMSO組神經(jīng)元突起長度為210.80?49.34um，顯著高于bpv+mTOR抑制劑組(141.22?25.15um)和bpv+AKT抑制劑組(140.46?26.16um)(P均<0

16、.001)。生理鹽水組神經(jīng)元突起長度為164.10?24.60um，也明顯高于bpv+mTOR抑制劑組和bpv+AKT抑制劑組(P均<0.01)。bpv+mTOR抑制劑組與bpv+AKT抑制劑組間神經(jīng)元突起長度無明顯差異(P>0.05)
　　 結(jié)論：1、PTEN抑制劑bpv在體外缺血模型中促進(jìn)原代皮層神經(jīng)元突起生長，主要是通過活化AKT/mTOR信號通路的作用。
　　 2、AKT/mTOR/S6信號通路活化可能是PTEN