人骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)定向誘導(dǎo)后的體內(nèi)移植研究.pdf

1、目的： 探討人骨髓基質(zhì)細胞在向神經(jīng)細胞定向誘導(dǎo)后體內(nèi)移植的存活及分化狀況。 方法步驟： 1.采用淋巴細胞分離液按密度梯度離心法分離成人骨髓，反復(fù)貼壁法純化擴增骨髓基質(zhì)細胞。 2.選用培養(yǎng)的第三代人骨髓基質(zhì)細胞(hMSCs)，先經(jīng)熒光染料Hoechst33342標(biāo)記24小時，DMEM反復(fù)漂洗5次，除去未結(jié)合的Hoechst；bFGF預(yù)誘導(dǎo)；再用阿魏酸鈉誘導(dǎo)24小時。誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)細胞分化。觀察細胞核熒光顯

2、色情況。 3.采用線栓法復(fù)制SD大鼠局灶性腦缺血再灌注動物模型，缺血2小時后行再灌注。 5.于再灌注24小時后將Hoechst33342標(biāo)記并阿魏酸鈉誘導(dǎo)后的hMSC經(jīng)栓塞側(cè)頸內(nèi)動脈輸入動物模型腦內(nèi)，每只大鼠移植hMSC約5×10<'6>/0.8ml。 6.移植第14天，麻醉大鼠，開胸經(jīng)心臟用PBS沖洗血管，用4％多聚甲醛灌注固定，取出腦組織用30％的蔗糖沉底。 7.將取出的腦組織自視交叉向后冠狀切取腦組

3、織冰凍切片，在熒光顯微鏡下尋找Hoechst33342標(biāo)記的細胞，采用免疫組織熒光染色法(FITC標(biāo)記二抗)檢測人細胞核特有抗體MAB1281陽性表達，并檢測神經(jīng)干細胞標(biāo)志物nestin及神經(jīng)元細胞標(biāo)志物NSE表達情況。 結(jié)果：1.hMSC經(jīng)阿魏酸鈉誘導(dǎo)24小時后，鏡下可見細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞圓縮并伸出突起，呈現(xiàn)神經(jīng)細胞樣形態(tài)，熒光顯微鏡下可見細胞核均顯藍色熒光。2．在移植了誘導(dǎo)后hMSCs兩周后的MCAO大鼠腦組織冰凍切