用于氣味分子丁二酮檢測(cè)的嗅覺受體蛋白ODR-10異源表達(dá)的研究.pdf

1、生物的嗅覺系統(tǒng)能識(shí)別和區(qū)分成千上萬種不同的氣味分子，具有很高的靈敏度和特異性。嗅覺和視覺、聽覺一樣，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物的生存具有重要的意義。生物界中大多數(shù)有機(jī)體依賴嗅覺進(jìn)行覓食、躲避天敵和交配等。自從嗅覺受體基因超家族首次被發(fā)現(xiàn)并克隆，嗅覺感知機(jī)制被闡明以來，人們對(duì)嗅覺的研究越來越感興趣。
　　 嗅覺感知，以哺乳動(dòng)物為例，起始于嗅覺受體蛋白與氣味分子的結(jié)合，受體配體結(jié)合物激活細(xì)胞內(nèi)G-蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的生物化學(xué)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，細(xì)胞

2、產(chǎn)生動(dòng)作電位，將氣味分子的化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成動(dòng)作電位的電信號(hào)，通過軸突把嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)到嗅球，經(jīng)過加工和修飾，輸入到大腦皮層的嗅覺信號(hào)處理中樞，在這里完成嗅覺信號(hào)的解碼，從而形成對(duì)氣味的感知，實(shí)現(xiàn)氣味的識(shí)別和辨別。
　　 嗅覺受體蛋白在氣味感知過程中起著重要的作用，它屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族，有7個(gè)跨膜區(qū)域。而嗅覺受體基因不含N-末端信號(hào)肽序列，當(dāng)克隆的嗅覺受體基因在異源細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，翻譯后的蛋白因缺乏信號(hào)肽的引導(dǎo)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯

3、留、聚集，甚至在蛋白酶的作用下降解，最終無法定位在細(xì)胞膜上。這也是目前研究嗅覺受體蛋白異源表達(dá)的熱點(diǎn)之一。
　　 隨著嗅覺感知機(jī)理的闡明，人們通過模仿嗅覺系統(tǒng)識(shí)別和分辨氣味的機(jī)理，以生物活性組分，如嗅覺受體神經(jīng)元、嗅覺受體蛋白等作為識(shí)別元件，結(jié)合各種二級(jí)傳感器，構(gòu)建了多種仿生嗅覺傳感器。仿生嗅覺傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、選擇性好等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物開發(fā)、食品和水源質(zhì)量控制等諸多領(lǐng)域，具有潛在的工業(yè)應(yīng)

4、用前景和商業(yè)價(jià)值。同時(shí)仿生嗅覺傳感器也為嗅覺傳導(dǎo)機(jī)理的深入研究提供了新的技術(shù)手段，如用于鑒定特異的嗅覺受體-配體對(duì)、研究嗅神經(jīng)元對(duì)刺激的響應(yīng)特性、細(xì)胞電生理等，從而促進(jìn)嗅覺傳導(dǎo)機(jī)理的研究。
　　 石英晶體微天平(quartzcrystalmicrobalance，QCM)是一種質(zhì)量敏感型傳感器，其檢測(cè)諧振頻率的改變△f與傳感器表面的質(zhì)量變化△m成線性關(guān)系，因而作為一種靈敏的檢測(cè)手段被廣泛用于生物微質(zhì)量檢測(cè)。近年來，該類傳感器結(jié)合

5、生物特異性識(shí)別材料構(gòu)成生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌、蛋白、小分子的微量變化差異的檢測(cè)。
　　 研究目的：
　　 通過分子生物學(xué)的方法構(gòu)建線蟲嗅覺受體基因odr-10真核表達(dá)載體，在異源細(xì)胞系統(tǒng)人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293)中表達(dá)ODR-10蛋白，為構(gòu)建仿生嗅覺傳感器提供識(shí)別元件——嗅覺受體蛋白。
　　 研究方法：
　　 將含有his標(biāo)簽和rho信號(hào)肽的序列插入到odr-10基因的N-端，并將其克隆到真核表達(dá)載體

6、pcDNA3.1(+)中，得到重組質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，分別利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Westernblot方法檢測(cè)目的基因和蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜上的定位，之后運(yùn)用鈣離子成像實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證表達(dá)蛋白是否具有識(shí)別特異性氣味配體的生物活性.最后提取目的蛋白，將其固定在生物傳感器QCM電極的表面，通過添加不同氣味刺激，檢測(cè)蛋白的活性及驗(yàn)證仿生嗅覺生物傳感器的功能。<

7、br>　　 研究結(jié)果：
　　 通過雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體his/rho/odr-10-pcDNA3.1。逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期目的片段大小一致，說明目的蛋白在RNA水平有表達(dá)，同時(shí)Westernblot結(jié)果顯示目的蛋白在細(xì)胞中有表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)目的蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)膜上。鈣離子成像實(shí)驗(yàn)通過激光共聚焦顯微鏡的觀察，結(jié)果顯示在添加刺激時(shí)細(xì)胞內(nèi)熒光增強(qiáng)，說明目的蛋白能識(shí)別其特異性配體丁二酮。