不同濃度的葡萄糖和胰島素對Colon26腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制物質(zhì)的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：腫瘤和糖尿病已成為當(dāng)今嚴(yán)重危害人類健康和生命的重大疾病，它們的發(fā)病率和死亡率逐年升高。近年來，越來越多的臨床和流行病學(xué)資料顯示，糖尿病人易患結(jié)直腸癌。糖尿病患者與非糖尿病患者比較，患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，已有人提出糖尿病是結(jié)直腸癌患病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病患者結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者，糖尿病人群中結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)率和死亡率亦明顯增加。糖尿病與結(jié)直腸癌的關(guān)系已經(jīng)成為備受人們關(guān)注的熱點(diǎn)；研究和揭示兩者之間的病理生理關(guān)系及其

2、分子機(jī)制，已成為該領(lǐng)域中迫切需要進(jìn)行探索的重要課題。
　　 腫瘤免疫學(xué)的研究已經(jīng)揭示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，不僅與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，在某種意義上更與腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制物質(zhì)抑制機(jī)體免疫功能，即腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用，是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，使腫瘤得以發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制，在促進(jìn)機(jī)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有極其重要的作用。腫瘤細(xì)胞通過其分泌的免疫抑制物質(zhì)，不但有可能在遠(yuǎn)離腫瘤部位的機(jī)體其他部位發(fā)

3、揮免疫抑制作用，更可在腫瘤局部形成深度免疫抑制區(qū)，即所謂“黑洞”區(qū)，以至于不僅使原本就在此區(qū)之中的原位免疫細(xì)胞功能嚴(yán)重受抑，而且還能使由此區(qū)之外進(jìn)入其中的功能正常甚至已經(jīng)活化的免疫細(xì)胞成為功能受抑的“沉默”細(xì)胞，從而使之失去有效清除腫瘤細(xì)胞的能力，顯然這是在即使免疫功能完全正常的機(jī)體中腫瘤也能逃避機(jī)體免疫監(jiān)視而得以發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制。
　　 糖尿病重要的病理生理特征之一，就是患者血中葡萄糖和胰島素水平的異常改變?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也正是

4、依據(jù)患者血中葡萄糖和胰島素水平的異常改變，將糖尿病的自然病程分為四個(gè)階段。糖尿病自然病程不同階段血中的葡萄糖和胰島素，各有與其所處病程階段相應(yīng)的不同濃度。糖尿病患者易患結(jié)直腸癌，是否與其自然病程不同階段血中不同濃度的葡萄糖和胰島素能影響結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制物質(zhì)有關(guān)，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道，十分需要對之進(jìn)行研究和探討。迄今，已見于報(bào)道能由腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制物質(zhì)多達(dá)20余種。其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因

5、子（VEGF）和白細(xì)胞介素-6（IL-6），是見諸報(bào)道較多、免疫抑制作用較強(qiáng)，并且也恰是可由結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞株Colon26腫瘤細(xì)胞分泌的三種重要的免疫抑制物質(zhì)。因此，本研究選用小鼠結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞株Colon26腫瘤細(xì)胞作為研究對象，以模擬糖尿病自然病程血中不同濃度的葡萄糖和胰島素對之進(jìn)行作用，測定是否對Colon26腫瘤細(xì)胞分泌這三種免疫抑制物質(zhì)有影響和有何影響，并初步探索是通過何種分子機(jī)制導(dǎo)致了這種影響。從影響結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞分泌

6、免疫抑制物質(zhì)的角度，為研究糖尿病與結(jié)直腸癌之間的病理生理關(guān)系，揭示糖尿病患者為何易患結(jié)直腸癌，提供新的研究思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：體外常規(guī)培養(yǎng)Colon26腫瘤細(xì)胞。根據(jù)培養(yǎng)液（RPMI1640完全培養(yǎng)基，CM）中外加葡萄糖和胰島素的終濃度不同，分為12個(gè)組：A組（對照組，Control），CM；B組（常糖組，nG），5mmol/L葡萄糖；C組（中糖組，mG），10mmol/L葡萄糖；D組（高糖組，hG），25mmol/L

7、葡萄糖；E組（常胰島素組，nI），5μIU/mL胰島素；F組（中胰島素組，mI），25μIU/mL胰島素；G組（高胰島素組，hI），125μIU/mL胰島素；H組（常糖常胰島素組，nGnI），5mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰島素；K組（常糖高胰島素組，nGhI），5mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰島素；L組（高糖高胰島素組，hGhI），25mmol/L葡萄糖和125μIU/mL胰島素；M組（高糖常胰島素組，hGnI），25

8、mmol/L葡萄糖和5μIU/mL胰島素；N組（高糖低胰島素組，hGloI），25mmol/L葡萄糖和1.25μIU/mL胰島素。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37℃5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞。ELISA法分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF、TGF-β1和IL-6的含量（pg/mL）。將所收集細(xì)胞抽提總RNA，采用RT-PCR法擴(kuò)增目的片段VEGF、TGF-β1、IL-6和內(nèi)參照β-actin，擴(kuò)增

9、產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上掃描分析，分別計(jì)算VEGF、TGF-β1和IL-6 mRNA相對表達(dá)量，表達(dá)強(qiáng)度以相對表達(dá)系數(shù)RC表示。全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果數(shù)據(jù)以三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的x±s表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.高濃度（25mmol/L）的葡萄糖可顯著增加Colon26腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β1和IL-6，其分子機(jī)制應(yīng)是由促進(jìn)Colon26腫瘤細(xì)

10、胞TGF-β1和IL-6基因轉(zhuǎn)錄所致。
　　 2.不同濃度[（5-25）mmol/L]的葡萄糖對Colon26腫瘤細(xì)胞VEGF的分泌和基因轉(zhuǎn)錄無影響。
　　 3.高濃度（125μIU/mL）的胰島素可顯著增加Colon26腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，其分子機(jī)制應(yīng)是由促進(jìn)Colon26腫瘤細(xì)胞VEGF基因轉(zhuǎn)錄所致。
　　 4.不同濃度[（1.25-125）μIU/mU的胰島素對Colon26腫瘤細(xì)胞TGF-β1和IL-6

11、的分泌及基因轉(zhuǎn)錄無影響。
　　 5.不同濃度的葡萄糖和胰島素聯(lián)合，不改變各自單獨(dú)對Colon26腫瘤細(xì)胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因轉(zhuǎn)錄的作用模式。
　　 6.不同濃度的葡萄糖和胰島素聯(lián)合，對Colon26腫瘤細(xì)胞VEGF、TGF-β1和IL-6的分泌及基因轉(zhuǎn)錄，既無協(xié)同效應(yīng)也無牯抗效應(yīng)。
　　 7.糖尿病自然病程中不同濃度的葡萄糖和胰島素可顯著增加結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞某些免疫抑制物質(zhì)分泌，應(yīng)是糖尿病