血脂康對(duì)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及可能分子機(jī)制.pdf

1、在許多心血管疾病發(fā)生時(shí),由于心肌負(fù)荷過重、缺血、缺氧和炎癥等原因常常會(huì)引起心肌纖維化的形成.心肌纖維化會(huì)降低心室壁的順應(yīng)性使心肌僵硬度增加而引起心室舒張功能障礙.心肌組織電興奮的離散度增加而易引起室性心律失常的發(fā)生；并可影響影響心肌細(xì)胞對(duì)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和心肌細(xì)胞能量的產(chǎn)生,是難治性心衰的組織病理基礎(chǔ),已成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn).心肌纖維化的成因主要是心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts,CFs)的活化、增殖及其所分泌的

2、膠原增生與沉積,CFs的增殖特性和功能改變是心肌纖維化的決定因素。 他汀類藥物系HMG-CoA還原酶抑制劑,是治療血脂異常的有效藥物,除此之外,近期臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)他汀類藥物可減輕左室質(zhì)量；洛伐他汀可抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AⅡ)誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞的肥大；阿托伐他汀可抑制CFs的增殖和膠原合成.血脂康為調(diào)節(jié)異常血脂的中藥,是由特制紅曲在特殊的工藝條件下發(fā)酵精制而成,化學(xué)組成比較復(fù)雜,有多種有效成分:

3、除明顯的降脂療效外,有研究顯示血脂康可改善高血壓患者的心室舒張功能,與安慰劑組比較,左心室肥厚的發(fā)展程度延緩,提示血脂康可延緩壓力負(fù)荷性左心室重塑,為更好地臨床應(yīng)用血脂康提供了新的視角.本研究以體外原代培養(yǎng)CFs為模型,進(jìn)一步研究血脂康對(duì)心肌纖維化的影響,探討了血脂康抑制CFs增殖和膠原合成的效果及其信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制,為預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),并觀察了其對(duì)原發(fā)性高血壓病患者左室舒張功能和心率變異性的影響,為更好使用血脂康

4、提供理論依據(jù)。 第一部分:心肌纖維化細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立 目的:CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞,在心肌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的形成中起重要作用.其增殖特性和功能的改變是心肌結(jié)構(gòu)改變的決定因素.AngⅡ具有生長(zhǎng)因子的作用,有上調(diào)細(xì)胞因子、促進(jìn)細(xì)胞增生和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝等作用,本實(shí)驗(yàn)中,我們建立了新生大鼠CFs的原代細(xì)胞培養(yǎng),觀察了AngⅡ處理對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響,建立了心肌纖維化的細(xì)胞培養(yǎng)模型,為開展藥物對(duì)CFs增殖

5、影響的實(shí)驗(yàn)提供可靠保證。 方法:心肌成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)采用胰蛋白酶消化及差速貼壁法.培養(yǎng)至細(xì)胞層融合后,用0.25％胰蛋白酶消化傳代,第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞形態(tài)觀察和免疫組織化學(xué)染色鑒定心肌成纖維細(xì)胞純度；臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性；噻唑藍(lán)比色法(MIT法)檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖；采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果:顯微鏡下觀察可見原代培養(yǎng)的CFS呈不規(guī)則三角形,胞質(zhì)淡而幾乎透明,折光弱,細(xì)胞核較大,

6、呈橢圓形,通常含2～3個(gè)核,無自發(fā)性搏動(dòng).臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞數(shù)大于97％.免疫細(xì)胞化學(xué)染色纖維連接蛋白染色呈陽性,波形蛋白染色呈陽性,血管平滑肌肌動(dòng)蛋白染色呈陰性,PBS對(duì)照呈陰性,符合成纖維細(xì)胞的染色特征,鑒定為所需的CFS,純度達(dá)98％。 MTT法測(cè)定AngⅡ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果可見,濃度為10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L和10-5mol/L的AngⅡ促進(jìn)了心肌成纖維細(xì)胞的增生,此作用呈濃

7、度依賴性,與正常對(duì)照組比較p<0.05,其中以10-6mol/L時(shí)OD值最大,差異十分顯著,以AngⅡ濃度為10-6mol/L作用于CFs 24 h,48 h,72h,CFs增殖呈時(shí)間依賴性,選取48h為AngⅡ作用時(shí)間以確保藥物作用充分。 結(jié)論:上述結(jié)果顯示,通過胰酶消化、差速貼壁法可獲高純度的新生大鼠原代培養(yǎng)CFs；.AngⅡ在濃度為10-6mol/L時(shí)可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖,選取48h為AngⅡ作用時(shí)間.此系統(tǒng)可作為心肌

8、纖維化研究的細(xì)胞培養(yǎng)模型,用于藥物對(duì)CFs增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分:血脂康對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響 目的:他汀類藥物可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞的肥大,且對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖有拮抗作用.血脂康中含有的Monacolins,該藥是否也具抑制心肌纖維化的作用尚未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)觀察了血脂康對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖及TGF-β1表達(dá)的影響,以期從細(xì)胞水平上探索血脂康是否具有預(yù)防和

9、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用；并探討其可能機(jī)制。 方法:實(shí)驗(yàn)采用上述心肌纖維化細(xì)胞培養(yǎng)模型,將第二代心臟成纖維細(xì)胞調(diào)整濃度為5×104細(xì)胞/m1,接種于培養(yǎng)板.待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí),吸去原培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,按分組不同分別加入不同刺激因素:(1)對(duì)照組:含10％胎牛血清的DMEM；(2)AngII組:AngII 10-6mol.L-1+含10％胎牛血清的DMEM；(3)AngII 10-6mol.L-1+血脂康30ug.ml-1

10、+含10％胎牛血清的DMEM；(4)AngII 10-6mol.L-1+血脂康150 ug.ml-1+含10％胎牛血清的DMEM；(5)AngII 10-6mol.L-1+血脂康750 ug.ml-1+含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)48 h后,用0.25％胰蛋白酶消化至細(xì)胞分離,收集各孔細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)或MTT法檢測(cè)CFs增殖情況:細(xì)胞周期分析也于處理48 h后進(jìn)行,采用碘化丙啶(PI)染色,在流式細(xì)胞儀檢測(cè)

11、,Modfit軟件分析細(xì)胞周期；血脂康對(duì)CFs分泌TGF-β1蛋白的影響采用ELISA法測(cè)定,按試劑盒說明方法進(jìn)行,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)A值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算TGF-β1濃度；化學(xué)比色法測(cè)定血脂康對(duì)CFs LDH活性的影響,按試劑盒說明方法進(jìn)行。 結(jié)果:用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定血脂康對(duì)AngII誘導(dǎo)的CFs增殖的影響,結(jié)果可見:AngII在濃度為10-6mol刺激CFs增殖,不同濃度的血脂康組細(xì)胞數(shù)均有不同程度的下降,并

12、隨濃度增加細(xì)胞數(shù)下降更明顯,呈劑量依賴性,與AngII組相比,差異有顯著性(P<0.01)；表明血脂康對(duì)AngII刺激的心肌成纖維細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用；用MTT比色法測(cè)定血脂康對(duì)CFs增殖的影響,所獲結(jié)果與細(xì)胞計(jì)數(shù)法基本一致.流式細(xì)胞儀測(cè)定血脂康對(duì)CFs細(xì)胞周期的影響:發(fā)現(xiàn)加入AngII后,心肌成纖維細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比F降,S期、G2/M期細(xì)胞百分比升高；血脂康組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著高于AngII組,而S期、G2/M

13、期細(xì)胞百分比明顯低于AngII組,且呈劑量依賴關(guān)系:表明血脂康具有阻止AngII的刺激細(xì)胞進(jìn)入增殖周期的作用.用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清的TGF-β1含量,與無血清DMEM對(duì)照組相比,Ang II(10-6mol.L-1)能明顯增加心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中的TGF-β1含量,血脂康能阻斷AngII的這種作用(P<0.01).化學(xué)比色法測(cè)定了細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活性,血脂康在30～750 ug.ml-1對(duì)細(xì)胞作用72h,LDH活性無顯著

14、性差異。 結(jié)論:本研究顯示血脂康具有抑制AngII誘導(dǎo)的CFs增殖的作用,這種作用不是血脂康本身的細(xì)胞毒性所致,有可能是通過抑制AngII刺激的細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)和/或阻止AngII刺激的細(xì)胞進(jìn)入增殖周期的作用實(shí)現(xiàn)的。 第三部分:血脂康對(duì)AII誘導(dǎo)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成及其機(jī)制的初步研究 目的:心肌纖維化包括成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,心肌膠原纖維成分不成比例地增多,排列紊亂,心肌間質(zhì)膠原合成和降解比例失調(diào)

15、等多個(gè)方面的改變.有報(bào)道表明AngII除促進(jìn)CFS的增殖外也促進(jìn)CFS膠原的合成。本研究的第二部分已觀察到血脂康可抑制CFS增殖,但血脂康干預(yù)后對(duì)I型膠原、III型膠原產(chǎn)生影響,以及其對(duì)細(xì)胞早期反應(yīng)基因蛋白c-fos和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1表達(dá)的影響,尚未見報(bào)道,本部分觀察了這些指標(biāo)的變化。 方法:CFs的培養(yǎng)和鑒定同第一部分；細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組同第二部分,用天狼星紅法分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中膠原蛋白含量.細(xì)胞總RNA提取采

16、用Trizol法,RT-PCR法檢測(cè)I、III型膠原、C-fos和TGF-β1mRNA的表達(dá),GAPDH用于作內(nèi)參照.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后紫外透射反射儀觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及亮度并攝影.使用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行密度分析,以GAPDH為內(nèi)參照,以各條帶與GAPDH條帶的密度比值代表相應(yīng)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)果:在細(xì)胞經(jīng)處理后48小時(shí)后,10-6mol的AngII使CFs膠原蛋白的產(chǎn)生增加,不同濃度的血脂康組膠原蛋

17、白產(chǎn)量均有不同程度的下降,并隨濃度增加下降更明顯,呈劑量依賴性,與AngII組相比,差異有顯著性(P<0.01).表明血脂康對(duì)AngII刺激的心肌成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生具有明顯的抑制作用.RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果可見,與對(duì)照組相比,Ang II(10-6mol/L)能明顯增加CFs c-fos、TGF-β1、I型膠原和III型膠原mRNA表達(dá),血脂康濃度>30μg/ml時(shí)能減弱AngII的這種作用,濃度大于150μg/ml時(shí)作用有顯著意義。