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1、目的:研究正常豚鼠心臟Na,K-ATPase α亞型的表達(dá)情況.方法:采用RNase保護(hù)分析法(RNase protection assay)檢測(cè)Na,K-ATPase α亞型的表達(dá).(1)合成α 1、α 2、α 3亞型特異性的放射性同位素標(biāo)記的cRNA探針:首先從豚鼠腦組織提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以其cDNA鏈作為PCR擴(kuò)增的模板,用各亞型特異的引物擴(kuò)增出cDNA雙鏈,擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將長(zhǎng)度相符的條帶在紫外燈下切下并純
2、化回收;隨后將回收的DNA片段與pGEM-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中,鑒定插入方向;選擇正向插入的重組子提取質(zhì)粒,經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒后利用T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出各亞型特異性的放射性標(biāo)記的cRNA探針.(2)分別用過量的cRNA探針與從靶組織提取的RNA雜交,并用RNase消化雜交體,由于RNase對(duì)單鏈專一,雙鏈則受到保護(hù)未被消化.另外,雜交體系還包括GAPDH的探針,以此來(lái)證實(shí)反應(yīng)過程中樣品未丟失.(3
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