雞抗EV71卵黃抗體制備及其抗病毒作用研究甲型H1N1流感病毒基因多態(tài)性對病毒復(fù)制及毒力的影響研究 季節(jié)性流感病毒H1N1 BALB-c鼠肺適應(yīng)株的建立及潛在分子機(jī)理研究.pdf

1、人腸道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)已被確認(rèn)為是手足口病的主要病原體之一,它所具有的嗜皮膚性和嗜神經(jīng)性,嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康,但目前缺乏特異、高效的抗病毒藥物。許多科技工作者正在研發(fā)各種類型的EV71疫苗,包括滅活疫苗、類病毒顆粒疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗,但疫苗的研究剛剛起步,尚處在動物實(shí)驗(yàn)階段,遠(yuǎn)沒有達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。EV71病毒抗體與人腦組織免疫交叉機(jī)制的發(fā)現(xiàn),推測疫苗直接免疫人體可能會引發(fā)神

2、經(jīng)毒副反應(yīng)。所以,探索一個(gè)能夠口服且無副作用的治療方法迫在眉睫。本課題研究外源給予的,不對人體直接免疫,口服卵黃抗體的治療方法,來防治手足口病。卵黃抗體(IgY)指特定抗原免疫蛋雞后從雞蛋中提取的針對特定抗原的抗體,是生物科學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)。自1893年Klemperer首次報(bào)道雞蛋中存在抗體以來,卵黃抗體的研究不斷深入,目前,卵黃抗體已被廣泛應(yīng)用于許多疾病的防治。受此啟示,本課題采用EV71滅活病毒作為抗原分五次免疫母雞,水稀

3、釋法提取卵黃抗體,ELISA方法檢測抗體滴度,結(jié)果顯示EV71卵黃抗體效價(jià)在第二次免疫后明顯升高,在第三次免疫后一周達(dá)最高峰；通過病毒中和實(shí)驗(yàn)對抗體的抗病毒作用進(jìn)行了研究,第三次免疫后1周卵黃抗體的中和指數(shù)是26.6,表明卵黃抗體在細(xì)胞水平具有良好的抗病毒作用,且該抗體對4種不同來源的C4亞型毒株均具有不同的抗病毒作用。我們的研究證實(shí)90％蛋雞經(jīng)免疫后均可產(chǎn)生中和指數(shù)大于24的中和抗體,可以用于大規(guī)模生產(chǎn)。由此可見雞免疫EV71后,可產(chǎn)

4、生具有良好體外抗病毒效果的卵黃抗體。而且卵黃抗體具有取材方便、提取方法比較簡單、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)條件簡單,適合大規(guī)模生產(chǎn)。本研究為手足口病重點(diǎn)防治及重癥患者的急救提供了抗體治療的思路。2009年4月,始發(fā)于墨西哥和美國的流感,是由一種新型甲型H1N1流感病毒引起的急性熱性呼吸道傳染病,短短數(shù)月,疫情蔓延全球,但在不同地區(qū)報(bào)道的重癥患者和病死率有較大差異,可能與病毒基因多態(tài)性有關(guān),因此,本文研究2009年甲型H1N1流感病毒基因序列多態(tài)

5、性對病毒復(fù)制及毒力的影響。病毒復(fù)制分析在MDCK細(xì)胞中進(jìn)行,毒力和致病性實(shí)驗(yàn)在BALB/c小鼠體內(nèi)進(jìn)行。選擇A/California/04/2009,A/Sichuan/1/2009和A/Beijing/3/2009三株病毒,分別感染MDCK細(xì)胞,48小時(shí)后A/Sichuan/1/2009病毒株的病毒RNA載量顯著高于其他兩株(P<0.05)；同時(shí)滴鼻接種BALB/c小鼠,觀察發(fā)病情況及存活率,觀察期為14天,80%的小鼠在接種A/Si

6、chuan/1/2009病毒后死亡,A/California/04/2009毒株感染后的存活率是60%,A/Beijing/3/2009病毒株感染后沒有出現(xiàn)死亡小鼠。感染后5天,當(dāng)病毒擴(kuò)散達(dá)高峰時(shí),接種A/Sichuan/1/2009株病毒液的小鼠肺組織病毒RNA載量顯著高于其他兩種毒株(P<0.05)；通過切片、HE染色、鏡下觀察,三種毒株感染小鼠的肺組織均有充血、出血、水腫、滲出等炎癥病理變化。接種A/Sichuan/1/2009病

7、毒株的小鼠,100%肺組織出現(xiàn)病變,接種A/California/04/2009病毒株的小鼠85%肺組織出現(xiàn)病變,接種A/Beijing/3/2009病毒株的小鼠肺組織出現(xiàn)病變的發(fā)生率是60%。另一方面,對三株病毒的全基因組進(jìn)行測序及序列比對,對其基因突變情況及多態(tài)性進(jìn)行分析。A/Sichuan/1/2009株全基因中有5個(gè)氨基酸發(fā)生了突變,其中PA蛋白中343位點(diǎn)的A突變?yōu)門,PB1蛋白中353位點(diǎn)的K突變?yōu)镽,566位點(diǎn)的T突變?yōu)锳

8、,PB2蛋白中471位點(diǎn)的T突變?yōu)镸,對病毒毒力的增強(qiáng)起重要作用。在本研究中,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明全基因組序列的多態(tài)性可能是決定2009年甲型H1N1流感病毒復(fù)制能力,毒力,及致病性不同的關(guān)鍵因素之一。2009年8月,根據(jù)香港最新的流感流行病學(xué)調(diào)查,H1N1亞型流感病毒占全部人際間流行株的49%,顯示該病毒已成主流流行株。因此,建立H1N1流感病毒感染的動物模型,尤其是從經(jīng)濟(jì)角度及遺傳背景角度最優(yōu)的BALB/c小鼠模型,對于疾病機(jī)理的深入

9、研究及新藥和疫苗的臨床前檢定都具有非常重要的意義。然而,野生型季節(jié)性流感病毒H1N1通過常規(guī)接種方式并不能感染小鼠,但研究發(fā)現(xiàn)通過將低毒力的病毒對小鼠肺組織進(jìn)行連續(xù)傳代,有望獲得毒力顯著增強(qiáng)的鼠肺適應(yīng)株病毒。本實(shí)驗(yàn)用毒力較弱的野生型季節(jié)性流感H1N1病毒滴鼻感染小鼠,通過在BALB/c小鼠肺組織中連續(xù)傳代,觀察小鼠存活情況及肺病理改變,來獲得季節(jié)性流感病毒H1N1的鼠肺適應(yīng)株及重癥感染模型。季節(jié)性流感H1N1A/Brisbane/59/

10、2007病毒野生型毒株,經(jīng)過在小鼠體內(nèi)進(jìn)行8次傳代后,毒力逐漸增強(qiáng),從無致病力到致死率達(dá)到100%。對鼠肺適應(yīng)株與野生型毒株進(jìn)行基因比對,發(fā)現(xiàn)適應(yīng)株HA基因發(fā)生了3個(gè)有義突變,最主要的是第89個(gè)位點(diǎn)上Thr至Ile氨基酸的改變。本實(shí)驗(yàn)對導(dǎo)致毒力增強(qiáng)的分子機(jī)制進(jìn)行了研究,為季節(jié)性流感病毒致病機(jī)理的深入研究,尤其是流感病毒的跨物種傳播機(jī)制,以及在此過程中所發(fā)生的環(huán)境選擇壓力下流感病毒的分子進(jìn)化行為均可提供重要的理論指導(dǎo),同時(shí)基于鼠肺適應(yīng)株建