hBMSCs腦內移植的安全評價、遷移、分化及遷移機制初探.pdf

1、背景：中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是一組嚴重威脅人類健康的疾病，主要包括腦血管疾病和神經(jīng)變性疾病，多表現(xiàn)為神經(jīng)元的變性缺失，神經(jīng)系統(tǒng)無法產生新的神經(jīng)元，建立新的突觸聯(lián)系，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后結構和功能難以恢復，而目前現(xiàn)有的臨床治療方法有限，不能達到有效恢復神經(jīng)功能的目的。因此尋找新的方法對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療至為關鍵。而干細胞移植為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病建立了一個新的技術平臺。 MSCs為中胚層來源的多能干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質中，以

2、骨髓組織中含量最為豐富。來源于骨髓的MSCs稱為骨髓MSCs( bonemarrow-derived MSCs, BMSCs)，其具有多向分化的潛力，獲取方便，易于分離培養(yǎng)和鑒定，遺傳背景穩(wěn)定，體內植入免疫反應比較弱等優(yōu)點。自從首次報道間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在腦內可以向神經(jīng)細胞分化后，MSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病就成為了非常感興趣的課題。本實驗采用的人BMSCs(human hBMS

3、Cs)來源于健康志愿者，前期工作已證實其在體外具有多向分化的潛能、并能快速擴增、可誘導免疫耐受、能減輕或抑制移植物抗宿主病等，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及血液病的臨床前期及臨床研究中頗受重視。目前MSCs的移植途徑主要包括直接腦內注射和間接通過靜脈、動脈及腹腔注射等。間接途徑移植為全身治療，到達病變部位的時間較長，細胞數(shù)量較少，發(fā)揮作用較慢等，而腦內注射移植為局部治療，創(chuàng)傷小，起效快，并且腦內的免疫應答能力比較弱，因此直接腦內注射成

4、為局部治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個很好的選擇。己有研究報道同種異體BMSCs小鼠腦內移植沒有發(fā)現(xiàn)明顯副作用，并能在大腦內遷移和向神經(jīng)細胞方向分化。但hBMSCs直接腦內移植的安全性如何?其腦內移植后能否進行遷移?能否分化為神經(jīng)元及其他神經(jīng)細胞?如果hBMSCs能夠在腦內進行遷移，其遷移途徑及遷移機制如何?這些都是hBMSCs臨床應用前期pR需解決的問題。方法我們分別利用小動物Wistar大鼠和與人類最為接近的非人靈長類動物食蟹猴作為研究對

5、象，腦內直接注射hBMSCs觀察hBMSCs直接腦內注射的安全性，通過對hBMSCs體外標記示蹤和攜帶的男性特異基因的檢測觀察hBMSCs在腦內的遷移及遷移途徑，應用免疫熒光雙標記觀察移植的hBMSCs在腦內的分化。Real-timePCR及免疫組織化學的方法用來檢測部分神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子以及薪附分子在hBMSCs移植后的表達情況。結果我們的結果顯示直接腦內注射hBMSCs未引起受試動物出現(xiàn)全身癥狀，包括精神、飲食、運動等方面。移植

6、hBMSCs的局部腦組織炎癥反應比較局限，未觀察到明顯的免疫反應，未觀察到腦組織的變性壞死和明顯膠質細胞聚集。hBMSCs移植4周后，仍大量存活，并可在腦內廣泛遷移，且遷移分布具有一定的規(guī)律性，可觀察到不同移植受體細胞分布重疊現(xiàn)象。hBMSCs遷移分布模式圖顯示不管是在大鼠，還是在食蟹猴，hBMSCs有從前腦向后腦遷移的趨勢。在大鼠，hBMSCs主要沿拼服體一外囊軸線和室管膜下方向遷移，而且隨著移植時間的推移，hBMSCs逐漸向對側遷移

7、:在食蟹猴，hBMSCs有向血管和室管膜下遷移的趨勢。因此我們推測血液循環(huán)和腦脊液循環(huán)可能是hBMSCs遷移的一個途徑之一。免疫熒光雙標記結果顯示移植的hBMSCs能表達神經(jīng)元的標記物NeuN和神經(jīng)膠質細胞的標記物GFAP，說明hBMSCs可在腦內向神經(jīng)細胞方向分化。hBMSCs移植后，部分神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子和神經(jīng)鈣粘素(N-cadherin)表達明顯升高。神經(jīng)鈣粘素介導神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的遷移，在細胞的遷移過程中也發(fā)揮重要

8、作用，因此，N-cadherin也可能誘導hBMSCs在腦內的遷移。我們應用hUCMSCs作為研究對象，應用transwell小室遷移系統(tǒng)檢測了N-cadherin對hUCMSCs的體外遷移作用，結果表明N-cadherin具有明顯趨化hUMSCs遷移的作用，并且發(fā)現(xiàn)其能夠上調細胞內源性N-cadherin和p連環(huán)蛋白的表達，因此N-cadherin也可能介導了hBMSCs在腦內的遷移。結論：hBMSCs直接腦內注射移植，沒有引起明顯的

9、副作用;hBMSCs可以在腦內長期存活，并能進行遷移和分化;hBMSCs移植后上調腦組織內部分細胞因子和神經(jīng)鈣粘素的表達，這可能是其在腦內遷移的一個機制之一。
　　 目的：探討食蟹猴腦缺血模型在人骨髓間充質干細胞(human bonemarrow2 derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)移植后對腦缺血損傷的保護作用和IL-10的表達情況。方法：食蟹猴8只，在腦定位儀定位下，應用光化學法構建

10、食蟹猴腦缺血模型，并將其隨機分為高劑量治療組、低劑量治療組和模型組，分別在腦缺血部位附近注射高、低密度的hBMSCs和生理鹽水。術后，通過影像學、神經(jīng)功能評分及組織病理學觀察對hBMSC的治療效果進行評價。并應用原位細胞凋亡檢測的方法觀察腦缺血周圍腦組織神經(jīng)細胞的凋亡情況，免疫組織化學的方法被用來觀察腦缺血周圍腦組織神經(jīng)膠質細胞反應和室管膜下細胞的增殖情況，并應用免疫組織化學、real-time PCR和Western blot檢測檢側

11、腦損傷周圍IL,-10的表達水平。結果與模型組相比，hBMSCs移植能明顯改善腦缺血模型的癥狀，hBMSC治療能夠減少損傷部位周圍細胞的凋亡，減輕腦缺血周圍腦組織的膠質細胞反應，促進室管膜下細胞的增殖。免疫組織化學顯示IL,-10陽性細胞的數(shù)量及染色強度均較模型組明顯升高，real-time PCR和Western Blot也證明1L-10在hBMSCs移植治療后表達升高。結論：IBMSCs對食蟹猴腦缺血模型具有修復作用，其治療機制可能