FGF8b對(duì)上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控及對(duì)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在歐美，尤其在美國前列腺癌的發(fā)病率仍超過肺癌，高居第一位；而在我國前列腺癌的發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致前列腺癌患者死亡的主要原因，前列腺癌細(xì)胞如何獲得侵襲轉(zhuǎn)移潛能目前尚不十分清楚。因此探討前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的抑制其侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)有重要的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。本課題擬先在組織學(xué)水平，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)方法檢測(cè)FGF8b、上皮標(biāo)志物(E—cadhe

2、rin)、間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin)在前列腺癌和良性前列腺增生(BPH)手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)情況，并探討FGF8b表達(dá)與前列腺癌臨床病理學(xué)因素的相關(guān)性以明確FGF8b表達(dá)在前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的可能作用。然后，選用DU145前列腺癌細(xì)胞株作為體外實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞，用RT-PCR、Western blotting等方法檢測(cè)上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物在FGF8b轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞株前后的改變以探討FGF8b能否誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化

3、(EMT)，以及對(duì)作用后前列腺癌細(xì)胞株遷移及侵襲能力的影響，最后探討FGF8b誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(EMT)的分子機(jī)制。通過本實(shí)驗(yàn)研究，將初步揭示前列腺癌中FGF8b表達(dá)意義及其促前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，并尋找在該過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵因子，為干預(yù)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移提供新的有效靶點(diǎn)。
　　 目的：探討FGF8b、E—cadherin和Vimentin在前列腺癌和BPH中的表達(dá)情況，并研究這三種蛋白與前列腺癌

4、臨床分期和病理分級(jí)的關(guān)系，從而為后續(xù)研究打下一定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：20例BPH標(biāo)本(55—78歲，平均62.4歲)和49例前列腺癌標(biāo)本(61-82歲，平均67.3歲)取自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院泌尿外科2002—2009年的手術(shù)標(biāo)本及經(jīng)直腸穿刺活檢存檔蠟塊，標(biāo)本系10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。前列腺癌標(biāo)本按照Gleason評(píng)分。前列腺癌患者術(shù)前均未接受內(nèi)分泌治療或其他治療。標(biāo)本4μm厚連續(xù)切片，分別做FGF8b、E—cadh

5、erin和Vimentin免疫組化染色，分析其表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：49例前列腺癌組織標(biāo)本中，共有33例表達(dá)不同程度的FGF8b，陽性表達(dá)率為67.35％(33/49)；20例BPH組織標(biāo)本中，無一例檢測(cè)到FGF8b表達(dá)。在前列腺癌組織和BPH組織中FGF8b的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在前列腺癌組織中有22例標(biāo)本E—cadherin表達(dá)缺失(22/49，44.90％)，27例(27/4

6、9，55.10％)陽性表達(dá)；Vimentin有29例(29/49，59.18％)表達(dá)陽性。統(tǒng)計(jì)分析顯示，上皮標(biāo)志物E—cadherin在前列腺癌組織中的表達(dá)缺失，以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的陽性表達(dá)均與前列腺癌的臨床分期和病理分級(jí)顯著相關(guān)(P<0.05)；FGF8b表達(dá)與前列腺癌的臨床腫瘤分期和病理分級(jí)顯著相關(guān)(P<0.05)，并且與E—cadherin表達(dá)缺失和vimentin陽性表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：<

7、br>　　 (1)人前列腺癌組織中有FGF8b表達(dá)，且其表達(dá)與前列腺癌臨床分期和病理分級(jí)相關(guān)；
　　 (2)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)缺失以及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的陽性表達(dá)均與前列腺癌的臨床分期和病理分級(jí)相關(guān)；
　　 第二章、FGF8b對(duì)上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控及對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU145生物學(xué)特性影響的研究
　　 目的：研究FGF8b基因轉(zhuǎn)染對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，探討其與上皮-間質(zhì)表型

8、轉(zhuǎn)化的關(guān)系。
　　 方法：以前列腺癌細(xì)胞株DU145為研究對(duì)象，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)將FGF8b基因轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定高表達(dá)FGF8b的FGF8b/DU145細(xì)胞模型：采用RT—PCR， Western-blot，MTT比色法以及Transwell小室等分子生物學(xué)技術(shù)和方法，深入研究FGF8b對(duì)DU145細(xì)胞上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響及對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：成

9、功建立了FGF8b穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞模型(FGF8b/DU145)：FGF8b轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞后，細(xì)胞變長(zhǎng)，細(xì)胞-細(xì)胞間隙增寬；通過RT—PCR、western-blot等方法進(jìn)一步檢測(cè)了FGF8b轉(zhuǎn)染前列腺痛細(xì)胞前后上皮、間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)的改變，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E—cadherin的表達(dá)水平與DU145細(xì)胞及PcDNA3.1-DU145細(xì)胞相比較顯著降低，而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組；細(xì)胞遷移

10、和細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF8b轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞后，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于對(duì)照組.
　　 結(jié)論：
　　 (1)FGF8b轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞后，DU145細(xì)胞的侵襲遷移能力增強(qiáng)：
　　 (2)FGF8b促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是誘導(dǎo)前列腺痛細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(EMT)。
　　 第三章、FGF8b調(diào)控前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究
　　 目的：探討FGF8b促進(jìn)前列腺

11、癌DU145細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制
　　 方法：western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞ERK1/2通路活性，然后將FGF8b/DU145細(xì)胞及DU145細(xì)胞在PD98059(ERK激酶MEK1抑制劑)作用下培養(yǎng)兩天，每天光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，最后Western-blot以及Transwell小室等方法，檢測(cè)各組細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物的變化以及細(xì)胞的遷移能力改變。
　　 結(jié)果：FGF8b/DU145組ERK1/2

12、活性明顯高于對(duì)照組，給予PD98059(ERR激酶MEK1抑制劑)后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E—cadherin蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯上調(diào)(P<0.05)；間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.05)；細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果提示，在給予PD98059后，F(xiàn)GF8b/DU145組細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組明顯減弱。
　　 結(jié)論：FGF8b調(diào)控前列腺癌細(xì)胞DU145發(fā)生上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化(EMT)可能由ERK激酶通路介導(dǎo)， MEK1作