鹽酸椒苯酮胺抗豚鼠耳蝸缺血-再灌注損傷作用及其機制.pdf

1、聽力障礙是影響公眾身體健康和生活質量的重要因素，數以億計的人受到威脅。世界衛(wèi)生組織2013年2月27日在日內瓦表示，全世界有3.6億人患有耳聾或聽力障礙，占全球人口的5％，其中三分之二在發(fā)展中國家。中國是世界上最大的發(fā)展中國家，有13億人口，聽力障礙殘疾人有2057萬，占全國人口的16.79％，絕大部分為感音神經性聾。感音神經性聾的病理改變主要是毛細胞損傷、螺旋神經節(jié)、支持細胞及神經末梢的器質性改變，發(fā)病原因公認有缺血、病毒感染、耳毒性

2、藥物中毒及老年性退行性變等，尤其缺血因素最為常見。而血流障礙中只有少數為單純的缺血損傷，大部分是缺血后的再灌注損傷。例如突發(fā)性耳聾，目前多認為是內耳微循環(huán)障礙所致的感音神經性聾。有研究指出缺血后再灌注造成的損傷大于單純缺血造成的損傷。所以探討內耳缺血/再灌注損傷(I/RI)的機制將非常有利于內耳疾病的研究。鹽酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride，簡稱椒苯酮胺，PPTA)是由中國醫(yī)學科學院藥物研究所合

3、成篩選出的化學創(chuàng)新藥。相關研究表明椒苯酮胺對缺血再灌注損傷的心肌具有保護作用，是鈣增敏劑類強心藥及心肌保護劑。另外有研究表明其對缺血再灌注損傷腦組織也有保護作用，但國內外尚無椒苯酮胺抗內耳缺血再灌注損傷作用的研究。本實驗從聽覺功能、細胞形態(tài)、炎性因子及細胞凋亡四個方面對豚鼠耳蝸的(I/RI)進行研究，旨在探討椒苯酮胺對內耳（I/RI）的保護作用及可能機制，為椒苯酮胺用于缺血性內耳疾病的治療提供藥理學依據。本研究分為四個部分：
　　

4、 第一部分：耳蝸缺血/再灌注(I/R)豚鼠模型的建立。
　　 目的：建立豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷模型，探討豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷后聽功能改變。
　　 方法：將24只健康、耳廓反射靈敏，體重200-250g豚鼠隨機分成3組，分別為正常組、空白對照組、缺血再灌注組。缺血再灌注模型通過暫時性微動脈夾夾閉雙側椎動脈、結扎線活結結扎右側頸總動脈，實驗中激光多普勒檢測耳蝸血流(CoBF)。各組動物分別于手術前、缺血再灌注6h、2

5、4h、48h行聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)測定，觀察ABR各波潛伏期、Ⅰ-Ⅲ波間期和Ⅲ波閾值。
　　 結果：正常組、假手術組術前、術后ABR閾值無顯著變化;缺血再灌注組再灌注6小時、24小時后ABR閾值顯著升高(P＜0.05)，24小時達到高峰，48小時ABR閾值有所恢復，但未恢復正常。
　　 結論：通過暫時性微動脈夾夾閉雙側椎動脈及右側頸總動脈，夾閉1小時制造缺血模型，

6、松開三條動脈制造再灌注模型。可致耳蝸損傷，表現為聽功能下降，在再灌注后6h、24h、48h，以24h聽閾最高，即耳蝸損傷最為嚴重。
　　 第二部分：PPTA時耳蝸缺血再灌注損傷的聽力保護作用及耳蝸組織掃描電鏡和透射電鏡觀察。
　　 目的：探討鹽酸椒苯酮胺(PPTA)對豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后聽功能及耳蝸形態(tài)的影響。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將32只豚鼠隨機分為4組，每組8只，每組4只用于掃描電鏡觀察

7、，剩余4只用于透射電鏡觀察。分為正常組，假手術組，缺血再灌注對照組，缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組再灌注后立即經股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺，缺血再灌注對照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射。測量實驗前后各組的聽性腦干反應(ABR)波Ⅲ反應閾的變化。24小時迅速斷頭取聽泡，在掃描電鏡、透射電鏡下觀察耳蝸結構。
　　 結果：⑴正常組、假手術組實驗前后ABR波Ⅲ反應閾值無顯著變化(P＞0.05)，缺血再灌注對照組，造

8、模成功后ABR波Ⅲ顯著升高(P＜0.05)，缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組，造模成功后ABR波Ⅲ升高，但低于缺血再灌注對照組(P＜0.05)。⑵掃描電鏡下觀察耳蝸組織的形態(tài)學變化:正常組及空白對照組豚鼠耳蝸基底膜居外側3排外毛細胞，1排內毛細胞呈刷狀，排列整齊，內、外毛細胞纖毛排列整齊，無缺失、倒伏。缺血再灌注對照組外毛細胞腫脹、缺失，纖毛排列紊亂、倒伏，部分缺失。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組少量外毛細胞有纖毛倒伏。⑶透射電鏡下觀察:正常組及

9、空白對照組耳蝸毛細胞細胞核圓、核染色質分布均勻，線粒體形態(tài)正常，分布均勻，毛細胞突觸結構清晰。螺旋神經節(jié)神經元未見明顯脫髓鞘改變，血管紋內皮細胞核呈梭形;IR組耳蝸毛細胞核邊界不清，可見固縮、邊集現象，突觸結構消失。螺旋神經節(jié)可見大量脫髓鞘改變。血管紋內皮細胞核可見固縮、邊集現象，呈現充血改變;缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組毛細胞核邊界清楚，核染色質分布均勻，線粒體形態(tài)分布均勻，無明顯腫脹，突觸結構尚清晰。螺旋神經節(jié)可見少量脫髓鞘變。血管紋

10、內皮細胞核膜完整，無固縮、邊集現象。
　　 結論：PPTA對豚鼠耳蝸的缺血再灌注聽力損傷有保護作用，并且可以防止耳蝸缺血再灌注損傷后毛細胞的損傷缺失。
　　 第三部分：鹽酸椒苯酮胺對缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表達的影響。
　　 目的：①探討耳蝸炎性反應與缺血再灌注損傷的關系。②探討缺血再灌注后豚鼠耳蝸IL-1β和TNF-α的mRNA的表達與炎性反應的關系。③探討PPTA對豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷的

11、保護作用機制。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將24只豚鼠隨機分為4組，每組6只，分別為正常組、假手術組、缺血再灌注對照組和缺血再灌注PPTA組。缺血再灌注PPTA組于缺血1小時再灌注后立即經股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺(10mg/kg)，缺血再灌注對照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射，24小時后取標本。用RT-PCR法檢測IL-1β和TNF-α的mRNA的表達。用SPSS13.0軟件對實驗數據進行方差分析，若滿足方差齊性，用

12、LSD檢驗比較組間差異，若不滿足方差齊性，用Dunnett'sT3比較組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：缺血再灌注對照組耳蝸組織IL-1βmRNA表達量顯著高于正常組和假手術組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護組耳蝸組織IL-1βmRNA表達量顯著低于缺血再灌注對照組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護組耳蝸組織IL-1βmRNA表達量與正常組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.056＞0.05)。缺血再灌

13、注對照組耳蝸組織TNF-α mRNA表達量顯著高于正常組和假手術組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護組耳蝸組織TNF-αmRNA表達量顯著低于缺血再灌注對照組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA保護組耳蝸組織TNF-αmRNA表達量高于正常組(P=0.009＜0.05)。
　　 結論：⑴PPTA具有拮抗耳蝸組織缺血再灌注損傷作用；⑵PPTA可能通過抑制炎性反應實現對耳蝸缺血再灌注損傷的拮抗作用。
　　 第四部分

14、 PPTA時豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后細胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表達的影響
　　 目的：①觀察缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸細胞凋亡的情況。②對缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表達與細胞凋亡間的關系進行分析。③探討PPTA對豚鼠缺血再灌注損傷后凋亡細胞的保護作用。
　　 方法：采用前述的缺血再灌注模型，將48只豚鼠隨機分為4組，每組12只，分別為正常組、假手術組、缺血再灌

15、注組對照組、缺血再灌注PPTA組（缺血60min行再灌注后立即經股靜脈注射10mg/kg鹽酸椒苯酮胺），缺血再灌注對照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射，24小時后取標本。用免疫組織化學法(SP)觀察Fas蛋白的表達和分布，并用Motic圖象分析系統(tǒng)分析單位面積下陽性細胞的積分光密度(IOD);用TUNEL法觀察細胞凋亡的情況;用RT-PCR法檢測caspase-1的mRNA的表達，并比較PPTA干預前后的變化。運用SPSS13.0統(tǒng)計軟

16、件對實驗數據進行方差分析，用LSD檢驗比較組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：免疫組織化學染色見正常組、假手術組和缺血再灌注PPTA組耳蝸血管紋、螺旋神經節(jié)、Corti器Fas表達為弱陽性，缺血再灌注組表達顯著增強。IOD值顯示正常組、假手術組、缺血再灌注PPTA組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，缺血再灌注組較其他三組顯著增強(P＜0.05)。TUNEL法顯示正常組、假手術組和缺血再灌注PPTA組耳蝸各部位

17、沒有或僅有個別部位出現細胞凋亡，缺血及再灌注對照組耳蝸凋亡細胞明顯增多，PPTA干預后凋亡細胞顯著減少。缺血再灌注組耳蝸組織Caspase-1 mRNA表達量顯著高于正常組、假手術組和缺血再灌注PPTA組(P＜0.001);缺血再灌注PPTA組耳蝸組織Caspase-1 mRNA表達量顯著高于正常組(P＜0.001);正常組和假手術組耳蝸組織Caspase-1mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.825)。
　　 結論：通過豚

18、鼠耳蝸缺血再灌注損傷模型PPTA及對照試驗。正常組豚鼠耳蝸各部位Fas為弱陽性表達，無或罕有凋亡細胞。缺血再灌注組Fas表達增強，凋亡細胞增多，進行干預后使凋亡細胞顯著減少。缺血再灌注耳蝸組織Caspase-1 mRNA的表達顯著增高，PPTA可部分但有效地降低Caspase-1 mRNA的表達。提示細胞凋亡是耳蝸缺血再灌組損傷的一種細胞損傷形式，PPTA可能通過抑制Fas蛋白及Caspase-1 mRNA的表達，通過減少細胞凋亡而對缺