BMP2介導(dǎo)的成骨通路在顱咽管瘤鈣化中的機(jī)制研究及顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立.pdf

1、背景：
　　 顱咽管瘤是一種沿顱咽管生長(zhǎng)的上皮源性腫瘤，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的先天性腫瘤之一，約占顱內(nèi)腫瘤的4.7％-6.5％。在兒童中所有顱內(nèi)腫瘤中其發(fā)病率約為6％-13％，在兒童鞍區(qū)腫瘤中的比例超過(guò)60％。1904年奧地利科學(xué)家Erdheim首次將顱咽管瘤與胚胎“垂體-咽導(dǎo)管”聯(lián)系起來(lái)，并將其作為一類(lèi)單獨(dú)的鞍區(qū)腫瘤進(jìn)行了描述。早期顱咽管瘤的命名經(jīng)歷過(guò)“Rathke's囊腫瘤”，垂體管腫瘤，顱咽導(dǎo)管腫瘤，釉質(zhì)細(xì)胞瘤等名稱(chēng)。1931年F

2、razier和Alpers首先使用了顱咽管瘤這一名稱(chēng)，1932年Cushing在其出版的《顱腦腫瘤》一書(shū)中，以“顱咽管瘤”為名稱(chēng)對(duì)其進(jìn)行了較為詳細(xì)的描述，統(tǒng)一了這個(gè)腫瘤的命名，并一直沿用至今。一百多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)顱咽管瘤的起源，發(fā)生等領(lǐng)域進(jìn)行了大量廣泛而深入的研究，但受限于研究模型及研究技術(shù)等限制，對(duì)腫瘤的病理學(xué)特征，腫瘤生物學(xué)特性等方面的認(rèn)識(shí)仍存在較大的爭(zhēng)議。
　　 顱咽管瘤屬于WHO-Ⅰ級(jí)的良性腫瘤，組織學(xué)上，顱咽管瘤可

3、分為:造釉細(xì)胞型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma ACP）和鱗狀乳頭型顱咽管（squamous papillary craniopharyngioma SPCP）兩種亞型，前者好發(fā)于兒童患者，多有鈣化、炎癥，囊性變等表現(xiàn)，后者以成人多見(jiàn)，實(shí)性腫瘤較多。顱咽管瘤生長(zhǎng)方式多樣，腫瘤所在的鞍區(qū)存在包括垂體柄，視神經(jīng)，視交叉，下丘腦等在內(nèi)的多個(gè)重要結(jié)構(gòu)，手術(shù)治療中如果要對(duì)顱咽管瘤進(jìn)行全切除，則容易損

4、傷周?chē)匾M織，造成相應(yīng)并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至引起死亡。而若僅對(duì)腫瘤行部分切除，則復(fù)發(fā)率極高。因此較好的切除顱咽管瘤并盡量不損傷其周?chē)匾Y(jié)構(gòu)一直是神經(jīng)外科醫(yī)生面臨的重要難題。
　　 在顱咽管瘤治療的諸多危險(xiǎn)因素當(dāng)中，鈣化是其中較為重要的一個(gè)。顱咽管瘤鈣化率高，成人鈣化率約60％，在兒童中鈣化率超過(guò)85％。大量臨床資料表明，顱咽管瘤的鈣化灶常與垂體柄、視交叉、頸內(nèi)動(dòng)脈，三腦室底等結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密，手術(shù)中對(duì)其完整剝離存在較大困難。顱咽管瘤

5、的鈣化灶以羥基磷灰石結(jié)合多種纖維構(gòu)成，大塊狀鈣化灶質(zhì)地多堅(jiān)韌，術(shù)中難以分割切除，整體取出則容易造成對(duì)周?chē)Y(jié)構(gòu)的損傷，引起嚴(yán)重后果。
　　 臨床病理資料顯示:發(fā)生鈣化的顱咽管瘤多為造釉細(xì)胞型，而鱗狀乳頭型則基本不發(fā)生鈣化。組織學(xué)上，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤與牙源性上皮腫瘤及組織存在較大的相似性。牙源性組織所特有的釉質(zhì)蛋白在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中也有表達(dá)，而在鱗狀乳頭顱咽管瘤中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。結(jié)合“垂體管”發(fā)育過(guò)程中的分化路徑，有學(xué)者認(rèn)為雖然在

6、來(lái)源上，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤和鱗狀乳頭型顱咽管瘤均來(lái)自于胚胎“垂體-口咽管”的殘余組織，但其起源位置并不相同，前者起源于口凹牙源性組織，而后者起源于頰粘膜組織。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(osteopontin OPN)在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤尤其是鈣化嚴(yán)重的顱咽管瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，而在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中表達(dá)較低。骨橋蛋白是一種細(xì)胞分泌型蛋白，由于其自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，骨橋蛋白對(duì)鈣鹽具有較強(qiáng)的親和力。因此，在骨質(zhì)及牙齒形成的過(guò)程中，

7、骨橋蛋白是細(xì)胞與礦物質(zhì)，細(xì)胞與細(xì)胞，礦物質(zhì)與礦物質(zhì)之間結(jié)合的“橋梁”蛋白。骨質(zhì)中的成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞等均能合成骨橋蛋白，其在骨質(zhì)合成，分解等代謝過(guò)程中均扮演了重要的角色。
　　 骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein BMP）是一種具有成骨誘導(dǎo)能力的生長(zhǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforminggrowthfactor-β TGF-β）超家族成員之一。除能誘導(dǎo)骨質(zhì)形成之外，BMPs參與了細(xì)胞的增殖

8、，分化及侵襲等生理過(guò)程。作為一種從骨質(zhì)中提取的生長(zhǎng)因子，BMPs能誘導(dǎo)新生骨的發(fā)生。目前臨床上將其作為促進(jìn)骨折愈合材料的應(yīng)用已有十多年。BMPs促進(jìn)骨質(zhì)形成主要與其聚集，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨表型有關(guān)。間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)BMP誘導(dǎo)之后，分化為成骨細(xì)胞進(jìn)而分泌出骨質(zhì)形成中所必須的各種蛋白如骨鈣素(osteocalcinOCN)，骨橋蛋白，膠原，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)等，進(jìn)而促進(jìn)了鈣鹽的沉積和骨質(zhì)的形

9、成。
　　 BMP對(duì)于牙齒的形成也具有重要作用，其具有誘導(dǎo)牙齒造釉細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的作用。Kumamoto等通過(guò)免疫組化，發(fā)現(xiàn)了BMP2，4，7及其受體在牙源性造釉細(xì)胞瘤及牙胚組織中的表達(dá)，并認(rèn)為這些蛋白及受體在牙源性組織及腫瘤的分化中具有重要的作用。在一些病理?xiàng)l件下如腫瘤鈣化，血管平滑肌鈣化等方面，BMP的同樣作用同樣突出。其能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞分化為成骨表型，并促進(jìn)鈣鹽在這些位置的沉積，產(chǎn)生異位鈣化/骨化。

10、r>　　 基于BMP在牙源性組織中的表達(dá)以及骨橋蛋白在顱咽管瘤鈣化中的重要作用，我們以BMPs家族中主要因子之一BMP2作為切入點(diǎn)，結(jié)合BMP2所介導(dǎo)的通路中具有成骨分化標(biāo)記作用的轉(zhuǎn)錄因子RUNX2及OSTERIX作為研究對(duì)象，回顧性地分析這三個(gè)成骨因子在顱咽管瘤中的表達(dá)，并結(jié)合顱咽管瘤組織學(xué)特點(diǎn)與這些因子在腫瘤中的表達(dá)部位及分布特點(diǎn)，探討顱咽管瘤鈣化的內(nèi)在機(jī)制。同時(shí)，我們利用前期工作中建立的顱咽管瘤原代細(xì)胞模型，以人重組的BMP2蛋

11、白刺激腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)BMP2通路中的重要因子RUNX2，OPN，ALP的表達(dá)，初步確定BMP2介導(dǎo)的成骨通路在顱咽管瘤中的調(diào)控作用，并以茜素紅染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMP2是否能直接刺激顱咽管瘤直接發(fā)生鈣化。最后，我們利用低免疫生物體雞胚作為載體，探討建立顱咽管瘤雞胚移植瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚行?，為下一步?shí)驗(yàn)提供更多可選擇的平臺(tái)。
　　 第一章
　　 一、BMP2，RUXN2及OSTERIX在顱咽管瘤中的表達(dá)目的檢測(cè)BMP2，RUNX2

12、及OSTERIX在顱咽管瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與顱咽管瘤鈣化的關(guān)系。
　　 方法：
　　 收集顱咽管瘤術(shù)后標(biāo)本，運(yùn)用免疫組化及Western-blot方法回顧性的分析顱咽管瘤病理分型及鈣化分級(jí)與BMP2，RUNX2及OSTERIX之間的相關(guān)關(guān)系以及這些蛋白間的相互關(guān)系;利用HE染色觀(guān)察顱咽管瘤鈣化灶及其他組織學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，結(jié)合三個(gè)成骨因子在顱咽管瘤中的表達(dá)位置及分布特點(diǎn)，分析成骨因子的表達(dá)模式與顱咽管瘤鈣化灶形成之間的關(guān)系。

13、
　　 結(jié)果：
　　 HE染色顯示:在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中，常可在同一標(biāo)本中觀(guān)察到鈣化相關(guān)上皮結(jié)構(gòu)渦旋狀細(xì)胞，“濕性”角化與鈣化灶同時(shí)存在同一視野之中，鈣化灶“生長(zhǎng)”于其所在的“濕性”角化結(jié)構(gòu)。部分顱咽管瘤鈣化標(biāo)本中可見(jiàn)含骨陷窩的類(lèi)骨樣組織。鱗狀乳頭型顱咽管瘤中均未發(fā)現(xiàn)鈣化灶。
　　 免疫組化結(jié)果顯示:造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中BMP2，RUNX2及OSTERIX分別在70.1％(54/77)，55.8％(43/77)

14、和50.6％(39/77)的標(biāo)本中表現(xiàn)出中等強(qiáng)度以上的表達(dá)（moderate and strongly positive expression:＞10％陽(yáng)性細(xì)胞）。鱗狀乳頭型顱咽管瘤中未觀(guān)察到BMP2，RUNX2及OSTERIX出現(xiàn)中等強(qiáng)度以上的表達(dá)。BMP2為漿和/或膜表達(dá)，RUNX2和OSTERIX表現(xiàn)為核/漿表達(dá)。三個(gè)成骨因子在渦旋狀細(xì)胞中表達(dá)均較強(qiáng)，而在外圍柵欄狀細(xì)胞中表達(dá)較弱。其中，RUNX2及OSTERIX常表達(dá)于渦旋狀細(xì)胞

15、及“濕性”角化和鈣化灶區(qū)域周邊細(xì)胞。在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中未發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)因子的表達(dá)。BMP2，RUNX2及OSTERIX在造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中的表達(dá)高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P值均＜0.001)。造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中BMP2，RUNX2及OSTERIX在不同鈣化級(jí)別分組中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001），并且它們的表達(dá)與鈣化級(jí)別呈正相關(guān)（P值均＜0.001）。BMP2，RUNX2及OSTERIX在發(fā)生鈣化的造釉細(xì)胞型顱咽管瘤

16、中的表達(dá)要高于鱗狀乳頭型顱咽管瘤(P值均＜0.001)，而在未發(fā)生鈣化的造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中的表達(dá)與在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BMP2，RUNX2及OSTERIX的P值分別=0.392，0.517，0.212)。BMP2，RUNX2及OSTERIX之間的相關(guān)性分析顯示造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中其兩兩之間均呈正相關(guān)關(guān)系（P值均＜0.001）。
　　 Western-blot結(jié)果顯示:造釉細(xì)胞型顱咽管瘤中BMP2，RU

17、NX2及OSTERIX的表達(dá)隨著鈣化級(jí)別的升高而升高，未鈣化的造釉細(xì)胞型顱咽管瘤和鱗狀乳頭型顱咽管瘤中這三種蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（BMP2，RUNX2及OSTERIX的P值分別=0.551，0.609，0.295）
　　 結(jié)論：
　　 BMP2及其所介導(dǎo)的通路中重要的成骨標(biāo)記性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2和OSTERIX在顱咽管瘤鈣化中扮演了重要的角色，BMP2可能是通過(guò)誘導(dǎo)顱咽管瘤發(fā)生成骨分化，最終引起腫瘤中發(fā)生鈣鹽沉積。

18、
　　 第一章
　　 第二節(jié)、人重組BMP2誘導(dǎo)顱咽管瘤細(xì)胞發(fā)生成骨樣分化研究
　　 目的：探討外源性人重組BMP2能否誘導(dǎo)顱咽管瘤細(xì)胞發(fā)生成骨分化并產(chǎn)生鈣化。
　　 方法：
　　 以外源性人重組BMP2刺激顱咽管瘤細(xì)胞，觀(guān)察其下游功能蛋白OPN基因的表達(dá)變化。確認(rèn)BMP2對(duì)OPN基因的刺激作用之后，進(jìn)一步以Western-blot檢測(cè)在BMP2刺激之后其成骨通路中的重要因子ALP，OPN及RUN

19、X2的表達(dá)情況以及當(dāng)BMP2的刺激作用受到其拮抗劑NOGGIN拮抗時(shí)這些因子的表達(dá)變化。最后以茜素紅染液對(duì)經(jīng)BMP2誘導(dǎo)之后的顱咽管瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，觀(guān)察與對(duì)照組相比其是否會(huì)發(fā)生明顯的鈣鹽沉積。
　　 結(jié)果：
　　 Q-PCR結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，在50ng/ml濃度下，OPN的含量開(kāi)始出現(xiàn)略微升高，并在200ng/ml濃度BMP2刺激下出現(xiàn)了顯著升高，四個(gè)病人樣本實(shí)驗(yàn)組與自身對(duì)照組相比其升高倍數(shù)分別為7.6倍、4.

20、9倍、8.7倍和5倍。
　　 Western-blot結(jié)果顯示: OPN及RUNX2在200ng/ml濃度BMP2刺激之后蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組（BMP2組VS.CON組）高（P值均＜0.001.）而ALP在這兩組間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.093)，三個(gè)蛋白BMP2組的表達(dá)量均比BMP2+NOGGIN組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ALP，OPN，RUNX2的P值分別為＜0.001,=0.029,＜0.001)。
　　

21、茜素紅染色實(shí)驗(yàn):經(jīng)過(guò)14天的誘導(dǎo)，BMP2組出現(xiàn)了明顯的鈣化灶及鈣鹽沉積，對(duì)照組無(wú)明顯變化。BMP2+NOGGIN組的鈣化比BMP2組低。
　　 結(jié)論：
　　 顱咽管瘤細(xì)胞可被外源性人重組BMP2誘導(dǎo)而發(fā)生成骨分化，成為一種類(lèi)成骨樣細(xì)胞并產(chǎn)生鈣鹽沉積;在BMP2刺激下，其下游成骨因子會(huì)發(fā)生相應(yīng)升高，并且這種作用會(huì)被NOGGIN所拮抗，顯示BMP2所介導(dǎo)的成骨通路是顱咽管瘤鈣化所依賴(lài)的重要途徑。
　　 第二章、顱咽

22、管瘤雞胚絨毛尿囊膜移植瘤模型的建立
　　 目的：初步建立顱咽管瘤雞胚絨毛尿囊膜(Chorioallantoic Membrane CAM)移植瘤模型，并評(píng)估移植瘤血管生成能力及細(xì)胞增殖能力。
　　 方法：
　　 利用術(shù)中所得顱咽管瘤組織，異種移植到雞胚CAM表面，建立移植瘤模型。對(duì)移植瘤瘤體周?chē)鶦AM血管進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估移植瘤CAM血管生成能力，同時(shí)利用免疫組化法以CD34標(biāo)記移植瘤微血管密度(Microvesse

23、l Density MVD)，以PCNA檢測(cè)移植瘤細(xì)胞增殖活性。
　　 結(jié)果：
　　 成功建立顱咽管瘤CAM移植瘤模型，造釉細(xì)胞型顱咽管瘤成瘤率為47.14％，鱗狀乳頭型顱咽管瘤成瘤率為43.33％，兩者無(wú)顯著差異(P=0.726);造釉細(xì)胞型移植瘤瘤周CAM血管生成能力，微血管密度及細(xì)胞增殖活性均高于鱗狀上皮型移植瘤。移植瘤的PCNA與MVD及CAM血管評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)及相應(yīng)P值分別為rs=0.649，P＜