都梁軟膠囊治療偏頭痛的藥效學(xué)及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　本文研究?jī)?nèi)容屬于重慶華森制藥有限公司委托項(xiàng)目。該制劑為上市中成藥（國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20055185），具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒之功效，主治頭痛屬風(fēng)寒瘀血阻滯脈絡(luò)癥者。但該藥缺乏藥效成分含量控制標(biāo)準(zhǔn)，主治頭痛的范圍缺乏現(xiàn)代疾病的限定范圍，缺乏治療偏頭痛的效果驗(yàn)證及其作用機(jī)制闡釋。委托單位擬進(jìn)行該制劑治療偏頭痛的藥效及其提取物的量效關(guān)系研究。該課題所屬項(xiàng)目“中藥大品種都梁軟膠囊技術(shù)改造”獲得科技部“重大新藥創(chuàng)制”專項(xiàng)(2010Z

2、X09401-306-3-4)資助。
　　目的:
　　研究都梁軟膠囊提取物改善偏頭痛模型大鼠的量-效關(guān)系，并在最佳用藥劑量基礎(chǔ)上，觀察都梁軟膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠的治療效果，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床用藥提供現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)和作用機(jī)制闡釋。
　　方法:
　　1.都梁軟膠囊主要成分的含量檢測(cè):采用高效液相色譜儀對(duì)都梁軟膠囊主要成分進(jìn)行含量檢測(cè)。其中，歐前胡素和異歐前胡素:色譜柱（ODS C18柱），流動(dòng)相（乙腈∶水

3、=52∶48），流速(1mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)(248 nm);阿魏酸∶色譜柱（ODS C18柱），流動(dòng)相（甲醇∶0.1％磷酸=35∶65），流速(1 mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測(cè)波長(zhǎng)(321 nm)。
　　2.都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛模型大鼠的量-效關(guān)系研究:SD雄性大鼠90只，180～220 g，隨機(jī)分成9組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊提取物6個(gè)不同劑量(0.13 g·kg-1

4、、0.39 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1)組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。隨后以30 min為一個(gè)觀察時(shí)間段，對(duì)大鼠造模后0～180 min進(jìn)行行為學(xué)觀察，記錄相關(guān)癥狀結(jié)果。造模

5、4h后，麻醉，取血，分離血清和血漿，放免法測(cè)定血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和內(nèi)皮素(ET)含量，酶免法測(cè)定血清一氧化氮(NO)含量。取血后迅速取腦，分離腦干，稱重，熒光分光光度法測(cè)定腦干內(nèi)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量。
　　3.都梁軟膠囊改善偏頭痛模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)觀察:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機(jī)分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量（0.44 g

6、·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1）組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。隨后以30 min為一個(gè)觀察時(shí)間段，對(duì)大鼠造模后0～180 min進(jìn)行行為學(xué)觀察，記錄相關(guān)癥狀結(jié)果。
　　4.都梁軟膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠血液生化指標(biāo)及腦干單胺類遞質(zhì)

7、的影響:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機(jī)分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量(0.44 g·kg-1、1.31g·kg-1、3.93 g·kg-1)組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。造模4h后，麻醉，取血，分離血清和血漿，放

8、免法測(cè)血漿CGRP、ET，紫外分光光度法測(cè)血清NO含量。取血后迅速取腦，分離腦干，稱重，熒光分光光度法測(cè)定腦干內(nèi)5-HT、NE、DA含量。
　　5.都梁軟膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠炎癥相關(guān)因子的影響:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機(jī)分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量（0.44 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1）組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg

9、-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。造模4h麻醉處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在冰上分離腦干，在4℃預(yù)冷的緩沖液中沖冼，并將組織分離成小塊，嚴(yán)格按照RIPA裂解液（強(qiáng)）和細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書操作，提取腦干組織總蛋白和胞核蛋白，BCA法測(cè)胞漿蛋白和核蛋白的含量。Western Blot法測(cè)定腦干胞核中核因子-kappaB

10、p65(NF-κB p65)、細(xì)胞癌基因fos(c-fos)蛋白的表達(dá)，及總蛋白中一氧化氮合成酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.都梁軟膠囊主要成分的含量檢測(cè):歐前胡素含量為1.54 mg·g-1，異歐前胡素含量為0.49 mg·g-1，阿魏酸含量為51.46μg·g-1。
　　2.都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛模型大鼠的量-效關(guān)系研究:
　　在行為學(xué)方

11、面，與正常組比較，模型組大鼠在整個(gè)觀察時(shí)間段(0～180 min)撓頭、爬籠次數(shù)顯著性升高(P＜0.01)，并出現(xiàn)耳紅癥狀;與模型組比較，都梁軟膠囊提取物0.13 g·kg-1、0.39 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組大鼠在造模0～60 min后撓頭、爬籠次數(shù)無(wú)下降趨勢(shì)，兩者比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05);1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1

12、、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組大鼠在造模90～180 min后撓頭、爬籠次數(shù)顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），且耳紅和爬籠消失時(shí)間顯著縮短(P＜0.01)。
　　在對(duì)血液及腦干生化指標(biāo)影響方面，與正常組比較，模型組血漿CGRP和血清NO顯著性升高，血漿ET和腦干5-HT、NE、DA含量均顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，都梁軟膠囊提取物1.31 g·kg-1、3.93 g·kg

13、-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，3.93g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組血漿ET含量顯著升高(P＜0.01)，1.31、3.93、13.13、39.39 g·kg-1組腦干5-HT、NE含量顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，39.39 g·kg-1組腦干DA含量顯著升高(P＜0.05)。
　　所有評(píng)價(jià)

14、指標(biāo)在1.31～39.39 g·kg-1范圍內(nèi)存在一定的量效關(guān)系。
　　3.都梁軟膠囊改善偏頭痛模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)觀察:與正常組比較，模型組大鼠在整個(gè)觀察時(shí)間段(0～180 min)撓頭、爬籠次數(shù)顯著性升高(P＜0.01)，并出現(xiàn)耳紅癥狀，顯示模型成功。與模型組比較，都梁軟膠囊0.44 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1組大鼠在造模0～60 min后撓頭、爬籠次數(shù)無(wú)下降趨勢(shì)，兩者比較無(wú)顯著性差異(P＞0.

15、05);1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1組大鼠在造模60～180min后撓頭、爬籠次數(shù)顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01)，且耳紅和爬籠消失時(shí)間顯著縮短(P＜0.01)。提示都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內(nèi)，給藥7天，能顯著改善造模60～180min偏頭痛模型大鼠行為學(xué)異常。
　　4.都梁軟膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠血液生化指標(biāo)及腦干單胺類遞質(zhì)的影響:與正常組比較，模型組血漿CGRP

16、和血清NO顯著性升高(P＜0.01)，血漿ET及腦干5-HT、NE和DA含量均顯著性降低(P＜0.01)。與模型組比較，都梁軟膠囊0.44 g·kg-1組腦干5-HT、NE、DA含量顯著升高(P＜0.01);1.31 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.01)，腦干5-HT、NE、DA含量顯著升高(P＜0.01);3.93 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.01)，血漿ET、腦干5-HT、N

17、E、DA含量顯著升高(P＜0.01)。提示都梁軟膠囊在0.44 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內(nèi)，給藥7天，能顯著改善偏頭痛模型大鼠血液生化指標(biāo)及腦干單胺類遞質(zhì)異常。
　　5.都梁軟膠囊對(duì)偏頭痛模型大鼠的炎癥相關(guān)因子的影響:與正常組比較，模型組大鼠腦干胞核內(nèi)NF-κB p65、c-fos及總蛋白內(nèi)iNOS、COX-2、IL-1β的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，都梁軟膠囊1.31 g·kg-1、3.9

18、3 g·kg-1組大鼠腦干胞核內(nèi)NF-κB p65、c-fos及總蛋白內(nèi)iNOS、COX-2、IL-1β的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。提示都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內(nèi)，給藥7天，能顯著改善偏頭痛模型大鼠炎癥相關(guān)因子異常。
　　結(jié)論:
　　1.建立了都梁軟膠囊主要成分的檢測(cè)方法，提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.成功復(fù)制了硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型，并運(yùn)用于都梁軟膠囊

19、相關(guān)研究中。
　　3.在對(duì)都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛的量-效關(guān)系研究中，都梁軟膠囊提取物0.13 g·kg-1、0.39 g·kg-1組均只有改善相關(guān)指標(biāo)的作用趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。其劑量在1.31 g·kg-1～39.39 g·kg-1范圍內(nèi)有明顯改善相關(guān)指標(biāo)的作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。其中，39.39 g·kg-1組對(duì)部分指標(biāo)的改善較13.13 g·kg-1組反而降低。
　　4.都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3

20、.93 g·kg-1劑量范圍內(nèi)，給藥7天，能顯著改善造模60～180 min偏頭痛模型大鼠行為學(xué)異常，改善血液生化指標(biāo)及腦干單胺類遞質(zhì)異常，以及改善炎癥相關(guān)因子異常。
　　5.都梁軟膠囊可顯著改善偏頭痛模型大鼠的血液和腦組織中，血管舒縮功能和神經(jīng)痛覺增敏相關(guān)指標(biāo)的異常變化，這可能是其治療偏頭痛的重要作用機(jī)制之一。
　　6.在硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠的腦干組織中，NF-κB通路介導(dǎo)的相關(guān)炎癥因子被激活，這證明了硝酸甘油致偏頭痛