牛副流感病毒3型C和V蛋白通過負(fù)調(diào)控IRF7拮抗I型干擾素表達的研究.pdf

1、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3，BPIV3)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，呼吸道病毒屬(Respirovims)的成員。BPIV3是單股負(fù)鏈的RNA病毒，能夠誘發(fā)牛呼吸道綜合征，引起牛產(chǎn)生副流行性感冒。多數(shù)牛感染BPIV3發(fā)病后，呈現(xiàn)食欲不振、發(fā)熱、結(jié)膜炎及咳嗽、氣喘、呼吸不暢等呼吸道感染癥狀，可引起母牛產(chǎn)奶量降低。牛群感染率高達90％，通常情況下在感染病毒的同時伴

2、有細菌的繼發(fā)感染使病情加劇，為我國養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。
　　已有研究報道呼吸道病毒均能夠通過抑制干擾素的生成來抵抗宿主天然免疫。例如仙臺病毒、人副流感病毒的C蛋白和V蛋白均能夠通過調(diào)控干擾素信號通路中的多種信號分子抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。BPIV3的C蛋白和V蛋白能夠抑制解旋酶視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(MDA5)的表達從而抑制IFN-β的生成，而C、V蛋白能否作用抗病毒天然免疫應(yīng)答中的其他分子來

3、逃脫宿主免疫的研究還未見報道。
　　為進一步探索BPIV3拮抗天然免疫的機制，本研究在胎牛腎細胞(MDBK)及牛肺細胞(BL)內(nèi)檢測BPIV3對干擾素信號通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的作用中得出，BPIV3能夠明顯抑制干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的表達。
　　過表達IRF7后能夠促進IFN-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄的激活，利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低MDBK細胞內(nèi)的IRF7基因的表達（命名為LV-IRF7shRNA-MDBK

4、），發(fā)現(xiàn)IFN-α和IFN-β以及干擾素下游通路的干擾素刺激因子15(ISG15)、干擾素刺激因子56(ISG56)和Mx1的表達量均降低，且與正常的MDBK細胞相比，LV-IRF7shRNA-MDBK細胞內(nèi)BPIV3的病毒滴度更強，證明了IRF7是機體抗病毒機制的關(guān)鍵因素。
　　本研究中克隆并表達BPIV3的C、V蛋白，制備C、V蛋白的多克隆抗體。將C、V基因載體分別轉(zhuǎn)染到MDBK細胞及BL細胞內(nèi)，利用qPCR及Western

5、blot檢測得出C、V蛋白均能夠抑制IRF7的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達。在抑制IRF7的同時，轉(zhuǎn)染C、V基因的細胞內(nèi)Ⅰ型干擾素IFN-α和IFN-β及下游相關(guān)分子ISG56、Mx1的表達量也降低。C、V蛋白能夠抑制過表達IRF7誘導(dǎo)的IRF7及IFN-α、IFN-β的轉(zhuǎn)錄，說明了C、V蛋白可能通過調(diào)控IRF7抑制Ⅰ型干擾素通路。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)C、V蛋白能夠有效地抑制BoIRF7、BoIFN-β啟動子及NF-κB啟動的熒光素酶的活性，