人臍血細(xì)胞靜脈輸注對(duì)血管性癡呆大鼠治療作用的研究.pdf

1、背景與目的：哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralneuralsystem,CNS)受損后的修復(fù)是有限的，受損的神經(jīng)元幾乎不能再生。目前，越來(lái)越多的研究將精力集中在細(xì)胞移植治療腦和脊髓病變方面。胚胎干細(xì)胞移植是治療CNS疾病最有希望的手段之一，但其廣泛應(yīng)用受到組織來(lái)源、免疫排斥及倫理學(xué)等諸方面的限制。骨髓干細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)一定條件培養(yǎng)可以表達(dá)nestin抗原并可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞已經(jīng)在CNS疾病如腦缺血及外傷等治療方面得到

2、了應(yīng)用。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植到受損動(dòng)物的CNS可以生長(zhǎng)成為神經(jīng)元。與骨髓及外周血相比，臍血具有免疫原性弱、淋巴細(xì)胞不成熟、來(lái)源豐富、易于采集及保存、無(wú)腫瘤細(xì)胞污染等優(yōu)點(diǎn)。臍血較骨髓含有更多的干細(xì)胞，而且這些干細(xì)胞更原始，提示臍血源性干細(xì)胞比骨髓源性干細(xì)胞更有治療應(yīng)用價(jià)值。目前也有報(bào)道將人臍血細(xì)胞(humanumbilicalcordbloodcells，HUCBCs)移植到CNS受

3、損(如腦缺血或脊髓損傷)的動(dòng)物模型中，從組織學(xué)及行為學(xué)改善方面證實(shí)了其有效性。血管性癡呆(vasculardementia，VaD)是指由于腦血管疾病引起的腦組織梗塞、低灌注或出血所致的認(rèn)知功能損害綜合征。目前，VaD成為老年期癡呆的第二大病因，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)。隨著人口老齡化和腦血管疾病發(fā)病率的上升，VaD的發(fā)病率也逐年上升。但對(duì)于VaD尚無(wú)特效治療方法。為此，本實(shí)驗(yàn)擬初步觀察HUCBCs靜

4、脈輸注對(duì)VaD大鼠行為和認(rèn)知功能的改善以及對(duì)腦組織保護(hù)及修復(fù)方面的作用。 方法：1.臍血的采集和分離選取健康無(wú)感染性疾病產(chǎn)婦，正常分娩的健康嬰兒做為臍血采集對(duì)象。采取健康成人外周血作為對(duì)照組。臍血與外周血均采集10份。以淋巴細(xì)胞密度梯度分離法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。 2.細(xì)胞鑒定采集臍血，分離HUCBCs，對(duì)其進(jìn)行nestin陽(yáng)性細(xì)胞鑒定。以成人外周血細(xì)胞(Humanperipheralbloodcells，HUPBCs)作為對(duì)

5、照組。以免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)HUCBCs中nestin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定性檢測(cè)。采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)臍血細(xì)胞中nestin陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)；同時(shí)，采用流式細(xì)胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)對(duì)HUCBCs和HUPBCs的細(xì)胞周期進(jìn)行比較。 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組大鼠隨機(jī)分為模型組(Modelgroup)、治療組(Treatmentgroup)、對(duì)照組(Controlgroup)，各組大鼠又分為2周(2W)、4周(4W)、8周(8W

6、)3個(gè)時(shí)相點(diǎn)。 4.動(dòng)物模型采用改良的Pulsinelli's四血管阻斷(4VO)法制作動(dòng)物模型。治療組于術(shù)后3小時(shí)內(nèi)由尾靜脈注射HUCBCs(3×106個(gè)/500μl)。應(yīng)用計(jì)算機(jī)控制的穿梭箱主動(dòng)回避反應(yīng)(activeavoidanceresponse，AAR)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 5.大鼠腦組織內(nèi)的HUCBCs檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)法對(duì)治療組大鼠腦組織內(nèi)HUCBCs進(jìn)行定性檢測(cè)。 6.凋亡細(xì)胞檢測(cè)采用T

7、dT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TerminaldeoxynucleotidyltransferasemediateddUPTnickend-labelling，TUNEL)法測(cè)定大鼠腦海馬組織的凋亡細(xì)胞。 7.血清NES、S-100蛋白含量檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linkedimmunoadsordentassay，ELISA)法測(cè)定大鼠血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase，N

8、ES)和S-100蛋白含量。 8.病理學(xué)觀察以光鏡和透射電鏡觀察各組大鼠腦組織病理變化。 結(jié)果：1.免疫細(xì)胞化學(xué)定性檢測(cè)可見(jiàn)HUCBCs有nestin陽(yáng)性染色細(xì)胞，對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞。FCM定量檢測(cè)顯示HUCBCs中nestin陽(yáng)性細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的4％，細(xì)胞周期分析顯示HUCBCs處于S期的細(xì)胞數(shù)明顯高于HUPBCs；而HUCBCs處于G1/0期的細(xì)胞明顯少于HUPBCs。HUCBCs處于G2/M期的細(xì)胞高于HUP

9、BCs，但二者無(wú)顯著差異。 2.穿梭箱測(cè)試結(jié)果顯示HUCBCs治療對(duì)VaD大鼠的行為學(xué)有明顯改善作用。模型組和治療組術(shù)前與對(duì)照組大鼠AAR百分比無(wú)明顯差異。模型組術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)大鼠AAR百分比較對(duì)照組顯著降低。治療組大鼠術(shù)后AAR百分比顯著低于對(duì)照組，但顯著高于模型組。 3.免疫組織化學(xué)方法分析顯示治療組大鼠腦組織中確有MAB-1281陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明HUCBCs能夠透過(guò)血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)

10、進(jìn)入大鼠腦中并存活。 4.對(duì)照組大鼠海馬僅見(jiàn)少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。模型組大鼠海馬區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞在術(shù)后2W最多，顯著高于對(duì)照組；術(shù)后4W、8W大鼠海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例有所下降，但仍顯著高于對(duì)照組。治療組大鼠術(shù)后2W時(shí)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，4W、8W凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組比較已無(wú)顯著差異。治療組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)凋亡細(xì)胞比例均顯著低于模型組。 5.模型組大鼠術(shù)后2W血清NSE含量顯著高于對(duì)照組；4W

11、時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異；術(shù)后8W則顯著低于對(duì)照組。治療組大鼠術(shù)后2W血清NSE含量顯著低于模型組；術(shù)后4W、8W則顯著高于模型組。治療組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)血清NSE含量與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異。 6.模型組大鼠術(shù)后2W血清S-100蛋白含量高于對(duì)照組，相差非常顯著；術(shù)后4W、8W時(shí)血清S-100蛋白含量顯著高于對(duì)照組。治療組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)血清S-100蛋白含量均顯著低于模型組，與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異。 7.各組大鼠腦組織

12、病理學(xué)改變：模型組可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)密度增高，線粒體腫脹，軸突水腫、變性、脫髓鞘等慢性缺血缺氧的病理改變。治療組上述改變明顯減輕，并可見(jiàn)處于修復(fù)過(guò)程中的有巨大核仁的細(xì)胞。 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)HUCBCs確能表達(dá)nestin抗原，表明臍血細(xì)胞中存在具有神經(jīng)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。這一結(jié)果為HUCBCs治療VaD提供了理論依據(jù)。 2.免疫組織化學(xué)方法證實(shí)HUCBCs能夠透過(guò)BBB進(jìn)入VaD大鼠腦組織，并存活。 3.TU