APC基因與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的初步研究.pdf

1、研究目的：子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在我國(guó)，近年來(lái)隨著人民經(jīng)濟(jì)生活的改善與發(fā)展，外源性雌激素的應(yīng)用、不孕等，其發(fā)病率亦顯著上升。目前對(duì)于該病的病因及發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不夠深入，缺乏對(duì)因治療。腫瘤分子生物學(xué)研究表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展與癌基因的激活及抑癌基因的失活有關(guān)。眾所周知，抑癌基因的失活有兩條途徑：基因內(nèi)突變和染色體物質(zhì)的丟失。但近期的研究表明：除去此兩種機(jī)制外，DNA甲基化也是腫瘤抑制基因失活的機(jī)制之一，DNA

2、甲基化是由酶介導(dǎo)的一種化學(xué)修飾，是將甲基(-ch3)選擇性的添加到DNA上。在某些情況下，DNA甲基化是腫瘤抑制基因失活的唯一機(jī)制。DNA甲基化降低了序列特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的親和力，MSP即methylation-specificPCR，是研究DNA甲基化最常用的方法，其作用機(jī)制：利用DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而此修飾對(duì)于甲基化的胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)無(wú)效。利用甲基化和非甲基化DNA單鏈序列的差異來(lái)設(shè)計(jì)不同的PCR引

3、物，而這類PCR引物就可以放大甲基化的DNA單鏈或非甲基化DNA單鏈。該方法靈敏度高，只需要很少量的DNA。 APC基因即adenomatouspolyposiscoli是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路上一個(gè)重要的抑癌基因，定位于染色體5q21，已有文獻(xiàn)證明APC基因表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本試驗(yàn)從分子生物學(xué)水平上研究了APC基因在正常的增生期子宮內(nèi)膜組織、不典型增生的子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的甲基化情況，以及該基因所表達(dá)的蛋白

4、在上述三種組織的石蠟切片中的表達(dá)情況，旨在探討APC基因的甲基化是否是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制之一，可否作為子宮內(nèi)膜癌基因治療的靶點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)方法：收集2004年3月～2006年2月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科住院并且接受手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者40例，取其腫瘤組織，同期計(jì)生門診診刮獲得的不典型增生的子宮內(nèi)膜組織30例，同期住院行全子宮切除患者的正常的增生期子宮內(nèi)膜組織30例，新鮮組織在離體1小時(shí)內(nèi)獲得，放入液氮內(nèi)保存。所取標(biāo)本一部分用

5、于提取DNA、RNA，另一部分用于做免疫組化試驗(yàn)。所取標(biāo)本的病理類型皆為子宮內(nèi)膜樣腺癌。按FIGO(1988年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ期29例，Ⅱ期7例，Ⅲ期4例?；颊吣挲g24～67歲，平均49.33歲。患者術(shù)前均未行化療、放療或免疫治療等抗腫瘤治療。提取其DNA、RNA，行MSP及RT—PCR等試驗(yàn)，檢測(cè)APC的甲基化情況；應(yīng)用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法(S-P法)，檢測(cè)APC蛋白在子宮內(nèi)膜癌、正常子宮內(nèi)膜、不典型子宮

6、內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。三種不同的組織標(biāo)本兩兩比較，采用Chi-square檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行分析，用Spearman相關(guān)系數(shù)檢測(cè)其相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。 結(jié)果：正常的增生期子宮內(nèi)膜組織中APC的甲基化率為23.33％(7/30)，不典型增生的子宮內(nèi)膜組織中的甲基化率為33.33％(10/30)，子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織中的

7、甲基化率為60％(24/40)。子宮內(nèi)膜癌組織與正常組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；子宮內(nèi)膜癌組織與不典型增生組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不典型增生組織與正常組織相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 正常的增生期子宮內(nèi)膜組織中APC的表達(dá)率為73.33％(22/30)，不典型增生的子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)率為63.33％(19/30)，子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織中的表達(dá)率為35％(14/40)。子宮內(nèi)膜癌組織與正常組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；子宮內(nèi)膜癌組織與不典型增生組

8、織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不典型增生組織與正常組織相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 免疫組化的結(jié)果表明：正常的增生期子宮內(nèi)膜組織中的蛋白表達(dá)率為66.67％(20/30)，不典型增生的子宮內(nèi)膜組織中的蛋白表達(dá)率為50％(15/30)，子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織中APC蛋白的表達(dá)率為12.5％(5/40)。子宮內(nèi)膜癌組織與正常組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；子宮內(nèi)膜癌組織與不典型增生組織相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不典型增生組織與正常組織相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、子宮內(nèi)膜癌APC基因的未甲基化率為40％，表達(dá)率是35％，蛋白的表達(dá)率為12.5％，三者分別行相關(guān)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中APC基因的未甲基化與其在RNA的表達(dá)情況呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.899；與其在蛋白質(zhì)中的表達(dá)情況呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.463；APC基因在RNA中的表達(dá)與其在蛋白中的表達(dá)也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.515。不典型增生組織中的未甲基化率與表達(dá)率相比，相關(guān)系數(shù)依次為0.929、0.707、0.761，皆呈正相關(guān)。正常組