二甲雙胍對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的抗炎及關(guān)節(jié)保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景和目的:
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid rthritis,RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的,系統(tǒng)性、炎癥性、自身免疫性疾病。致殘率高,是造成我國人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要疾病之一。其病理特點(diǎn)為累及周身關(guān)節(jié)的增生性和侵蝕性滑膜炎,呈進(jìn)行性病變,終生反復(fù),最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕畸形、功能喪失。盡管RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,但研究證實(shí):RA滑膜組織中浸潤的單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子通過

2、作用于多種細(xì)胞并相互調(diào)節(jié),形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),最終導(dǎo)致了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。實(shí)驗(yàn)證實(shí),TNF-α是在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中居于中心地位的炎癥因子,它不僅能夠通過NF-κB、JAK/STAT等通路介導(dǎo)RA的炎癥及關(guān)節(jié)破壞反應(yīng),還可促使滑膜細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等以自分泌或旁分泌的形式產(chǎn)生多種炎癥因子,例如IL-1β、IL-6等,共同作用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥及關(guān)節(jié)破壞反應(yīng)。所以以TNF-α為靶點(diǎn)的TNF-α拮抗劑-依那西普(et

3、anercept)、阿達(dá)木單抗(adalilmumab)等為代表的生物制劑的出現(xiàn),被認(rèn)為是RA治療的革命性變化。但是生物制劑昂貴且生物安全性尚有待實(shí)驗(yàn)繼續(xù)證實(shí),所以未被廣泛應(yīng)用。而且目前標(biāo)準(zhǔn) RA用藥包括非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAID)、激素、改善 RA病情藥物(disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)并不能夠改善患

4、者遠(yuǎn)期癥狀并且有較強(qiáng)的毒副作用。所以,尋找新的改善RA病情藥物仍然是臨床面臨的挑戰(zhàn)性問題。近年來研究表明,二甲雙胍不僅可以發(fā)揮全身性的抗炎作用,降低炎癥因子水平,升高抗炎因子水平;還能夠減弱炎癥因子介導(dǎo)的軟骨分解作用,維持體內(nèi)軟骨穩(wěn)態(tài),保護(hù)軟骨;還可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生來抑制破骨細(xì)胞的生成,減少破骨細(xì)胞的分化,保護(hù)骨質(zhì);最終起到關(guān)節(jié)保護(hù)的作用。本研究擬在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型上證實(shí)二甲雙胍對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型具有抗

5、炎和關(guān)節(jié)保護(hù)的作用。
　　目的:
　　1.研究二甲雙胍對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的抗炎作用;
　　2.研究二甲雙胍對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的關(guān)節(jié)保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.于4℃下,將Ⅱ型膠原溶于0.01 mol/L醋酸中,制成最終濃度為2mg/ml的混合液,靜置過夜,待其完全溶解;
　　2.冰浴下,用高速勻漿機(jī)將混合液與完全弗氏佐劑以1:1相配比制成乳劑;
　　3.在

6、大鼠尾部、肛周處皮膚多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.3ml乳劑,實(shí)驗(yàn)第7日重復(fù)操作,加強(qiáng)誘導(dǎo)一次;
　　4.造模成功后,于實(shí)驗(yàn)第7日隨機(jī)分組,給予各用藥組高劑量二甲雙胍(100mg/kg/d),低劑量二甲雙胍(50mg/kg/d),甲氨蝶呤(2.7mg/kg/w)灌胃干預(yù)治療;
　　5.每隔2日對(duì)各組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分及距骨寬度測(cè)量,于第28日處死取材,再進(jìn)行大鼠踝關(guān)節(jié)X片,MICRO-CT三維數(shù)據(jù)重建,HE染色,大鼠血清中炎癥因子水平及抗

7、炎因子水平等檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.連續(xù)觀察大鼠后足關(guān)節(jié)炎評(píng)分及距骨寬度測(cè)量示:高劑量二甲雙胍組關(guān)節(jié)炎評(píng)分及距骨寬度較誘導(dǎo)組顯著降低(P<0.05),其余兩用藥組較誘導(dǎo)組也有一定降低關(guān)節(jié)炎評(píng)分及距骨寬度的作用(P<0.05);
　　2.Elisa結(jié)果示:誘導(dǎo)組大鼠血清中炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平顯著升高,抗炎因子IL-10水平顯著降低;高劑量二甲雙胍治療組可顯著降低大鼠血清中炎癥因子TNF-α,I

8、L-1β,IL-6水平(P<0.05),升高抗炎因子IL-10水平(P<0.05);低劑量組及甲氨蝶呤治療組大鼠血清中炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-6水平較誘導(dǎo)組有所降低(P<0.05),抗炎因子IL-10水平也有升高(P<0.05)。
　　3.X片示:誘導(dǎo)組出現(xiàn)嚴(yán)重的軟組織腫脹和骨質(zhì)吸收,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞,嚴(yán)重?fù)p毀;高劑量二甲雙胍組可顯著保留關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)并使其免受侵蝕,而低二甲雙胍劑量組和甲氨蝶呤治療組效果比高劑量二甲雙胍組弱;

9、
　　4.MICRO-CT結(jié)果示:誘導(dǎo)組出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)吸收、溶解現(xiàn)象,骨質(zhì)表面十分毛糙,并出現(xiàn)空洞,關(guān)節(jié)完全損毀;高劑量二甲雙胍治療組:未出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)吸收、溶解現(xiàn)象,骨質(zhì)表面有些毛糙、未出現(xiàn)空洞,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)保存完整;甲氨蝶呤治療組及低劑量二甲雙胍治療組:同樣出現(xiàn)出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)吸收、溶解現(xiàn)象,骨質(zhì)表面十分毛糙,同時(shí)大量出現(xiàn)骨質(zhì)空洞,關(guān)節(jié)完全損毀,程度均較B組結(jié)果有所降低。
　　5.HE染色結(jié)果示:誘導(dǎo)組HE染色結(jié)果示:出現(xiàn)云片

10、狀炎癥細(xì)胞,深染藍(lán)色,炎癥細(xì)胞嚴(yán)重侵蝕骨質(zhì),關(guān)節(jié)間隙消失,完全被炎癥細(xì)胞填充;甲氨蝶呤治療組及低劑量二甲雙胍治療組兩組HE結(jié)果:出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞,分布于關(guān)節(jié)間隙和軟骨及骨質(zhì)中,關(guān)節(jié)間隙分辨不清,炎癥細(xì)胞同樣嚴(yán)重侵蝕骨質(zhì),關(guān)節(jié)間隙幾乎消失,被大量炎癥細(xì)胞充斥;高劑量二甲雙胍治療組HE結(jié)果出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞,,呈零星分布于關(guān)節(jié)間隙,關(guān)節(jié)間隙正常、清晰,炎癥細(xì)胞未嚴(yán)重侵蝕骨質(zhì),粉紅色軟骨、深紅色骨質(zhì)均清晰可見,很少破壞。
　　結(jié)論: