正反義人骨唾液酸蛋白基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)瘤細(xì)胞粘附侵襲行為的影響.pdf

1、孝中科教大署博士學(xué)位論文Jj一成義人骨睡渡酸蛋向基l川存?zhèn)H肉瘤自I『胞中fr：J表達(dá)蓯劉!_f細(xì)胞粘5fj佳襲行為的影響申請(qǐng)^址輯指導(dǎo)敬ll_lI學(xué)科專、№研究方向論衛(wèi)蓮止h州黃濤啡宣民教接外科學(xué)t矯)B，科)嗣腫蠕2f104q：i’，幾車2096q1RH硝躋睢t≯院礬亂牛部()【】^印∞月華中科技大學(xué)『n1濟(jì)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文正反義人骨唾液酸蛋白基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)瘤細(xì)胞粘附侵襲行為的影響中文摘要【摘要】：目的構(gòu)建正、反義人骨

2、唾液酸蛋白基因真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究人BSP的生物學(xué)作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；檢測人骨唾液酸蛋白正、反義真核表達(dá)載體在骨肉瘤細(xì)胞MG63中的表達(dá)；初步探討人骨唾液酸蛋白正、反義真核表達(dá)載體在骨肉瘤粘附侵襲行為中的作用。方法以RTPCR方法從人骨膜的總RNA中擴(kuò)增出hBSP的開放閱讀框序列，與克隆載體pUCm刖掛行連接，構(gòu)成克隆質(zhì)粒。利用引物兩端所設(shè)計(jì)的不同酶切位點(diǎn)將正反義目的片段定向亞克隆到真核表達(dá)載體plRF強(qiáng)2一EGFP，將重組后的質(zhì)粒

3、進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒擴(kuò)增、純化后，酶切、測序證實(shí)其中有目的片段完整插入。分別將正義、反義和空質(zhì)粒以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入MG一63細(xì)胞，通過RTPCR檢測各組細(xì)胞中hBSPmRNA表達(dá)，通過Westernblot檢測各組細(xì)胞中hBSP蛋白表達(dá)。MTI法懨0定轉(zhuǎn)染細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的粘附情況，重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)測定BSP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲力的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定轉(zhuǎn)染BSP質(zhì)粒對(duì)瘤細(xì)胞遷移情況的影響。結(jié)果從人骨膜細(xì)胞中成功擴(kuò)增出hBSP的開放閱讀框

4、序列，與pUCmTJ奎接構(gòu)建成功BSP克隆質(zhì)粒，通過亞克隆過程，與pIRES2EGFP真核表達(dá)載體連接，成功構(gòu)建了人BSP正反、義核酸真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞后能夠有效表達(dá)hBSP，與對(duì)照組相比，正義轉(zhuǎn)染組高表達(dá)hBSP，瘤細(xì)胞粘附率提高(PO05)，侵襲力增強(qiáng)(PO05)，遷移速度增快(PO05)。反義轉(zhuǎn)染組低表達(dá)hBSP，瘤細(xì)胞粘附率降低護(hù)O05)，侵襲力受到抑制∞O01)，遷移速度減慢(PO05)。而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未處理瘤