大花羅布麻葉對(duì)多巴胺能神經(jīng)的保護(hù)作用研究.pdf

1、帕金森癥（Parkinson’s disease, PD）是以腦部黑質(zhì)中多巴胺能（dopaminergic， DA）神經(jīng)元變性、丟失和死亡為病理特征的一類神經(jīng)退行性病變的疾病，患者常常會(huì)出現(xiàn)震顫麻痹、姿勢(shì)僵硬、行動(dòng)障礙等癥狀。該病在老年人中發(fā)病率較高，有隨年齡增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)，是目前僅次于阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease, AD）的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病。PD發(fā)病病因目前仍不甚清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為除與年齡高度相關(guān)外，長(zhǎng)期

2、與環(huán)境毒素接觸、遺傳和神經(jīng)炎癥等也是導(dǎo)致該病的重要相關(guān)因素。1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）能夠選擇性的被多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）結(jié)合，運(yùn)送至DA神經(jīng)元，而后通過抑制細(xì)胞線粒體復(fù)酶I而干擾呼吸鏈，影響細(xì)胞的能量供應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生大量超氧陰離子，這些超氧陰離子和一氧化氮反應(yīng)生成過氧亞硝酰陰離子，這些物質(zhì)能夠產(chǎn)生過度氧化應(yīng)激而嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞導(dǎo)致其死亡。谷氨酸（glutamate, Glu）作為一種極其重要的神經(jīng)遞質(zhì)，過量后能夠抑制內(nèi)源性谷胱甘

3、肽的合成，并伴隨活性氧簇（reactive oxigen spieces, ROS）大量堆積而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。LPS是一種強(qiáng)烈的炎癥誘導(dǎo)因子，能夠激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，釋放NO，PGE2等多種炎癥因子，使細(xì)胞處于過度應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致死亡。三種物質(zhì)經(jīng)常用來制備DA神經(jīng)受損模型進(jìn)行PD病理和藥物研究。1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）是MPP+的前體物質(zhì)，能夠造成靈長(zhǎng)類動(dòng)物的PD癥狀，最初是在美國吸毒青年中發(fā)現(xiàn)。MPTP本身

4、不具有毒性，高度的親脂性使其很容易通過血腦屏障而進(jìn)入大腦，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被單胺氧化酶（MAO-B）轉(zhuǎn)化為毒性形式MPP+而對(duì)DA神經(jīng)元造成損害，出現(xiàn)PD癥狀，作用機(jī)制與MPP+細(xì)胞損傷模型一致。MPTP是最為常用的致急性PD動(dòng)物模型藥物。
　　 大花羅布麻葉是傳統(tǒng)的降壓中藥，同時(shí)還具有延緩衰老和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的活性?；瘜W(xué)成分分析表明其中黃酮類成分含量較高，以槲皮素及其苷類為代表成分，研究報(bào)道槲皮素等黃酮類物質(zhì)具有神經(jīng)保護(hù)作用。

5、近期在對(duì)羅布麻抗抑郁作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，羅布麻葉水提取物能夠影響多巴胺、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的分泌。羅布麻與大花羅布麻葉具有類似的化學(xué)成分和藥理活性，但對(duì)大花羅布麻并未進(jìn)行過神經(jīng)系統(tǒng)方面的系統(tǒng)研究。本課題擬對(duì)大花羅布麻葉水提取物中的黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并研究其對(duì)DA神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)大花羅布麻的藥理活性進(jìn)行新的探索研究，為PD的中藥治療積累研究資料。
　　 1．大花羅布麻葉水提取物黃酮類化學(xué)成分分離鑒定和含量測(cè)定目的

6、：分離大花羅布麻葉水提取物中黃酮類化學(xué)成分，鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)；以分離得到的單體化合物作為對(duì)照品，測(cè)定它們?cè)诖蠡_布麻葉原藥材（E0）、羅布麻霜（E1）、大花羅布麻葉黃酮富集物（E2）中的含量。方法：大花羅布麻葉3kg加水煎煮提取2次，依次加入10、8倍水量，合并提取液，過濾后減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇至含醇量為20%，過夜沉淀除去少量雜質(zhì)。取上清液濃縮至無醇味后，通過HPD-100型非極性大孔吸附樹脂，以含水乙醇梯度洗脫，收集30

7、%乙醇洗脫物繼續(xù)通過Sephadex-LH 20柱層析，以含水甲醇洗脫。通過對(duì)大花羅布麻葉的水提取物進(jìn)行系統(tǒng)層析后，經(jīng)反復(fù)分離純化得到三個(gè)黃色單體化合物。以高效液相色譜法對(duì)三個(gè)化合物分別在大花羅布麻葉原藥材（E0）、羅布麻霜（E1，大花羅布麻葉水提取物）、大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，由E1通過HPD-100型大孔吸附樹脂以30%乙醇洗脫所得）中的含量進(jìn)行了測(cè)定。對(duì)于槲皮素的測(cè)定采用2005版中國藥典規(guī)定的鹽酸水解后再行測(cè)定的方法進(jìn)行。

8、結(jié)果：經(jīng)過理化性質(zhì)分析和光譜學(xué)確證，參考文獻(xiàn)后確認(rèn)三個(gè)單體化合物分別為槲皮素（Q1）、羅布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）。三種物質(zhì)中的含量測(cè)定結(jié)果見表1。結(jié)論：大花羅布麻葉水提取物中槲皮素-3-O-葡萄糖苷得率最高，大孔樹脂結(jié)合Sephadex LH-20分離大花羅布麻葉黃酮苷類物質(zhì)得率高于硅膠柱層析法。大花羅布麻相關(guān)藥材中游離槲皮素含量很低，加酸水解后測(cè)定其在大花羅布麻葉原藥材、羅布麻霜、大花羅布麻葉黃酮富集物中含量

9、均不低于0.6%，符合藥典要求。
　　 2．大花羅布麻葉的抗氧化能力和對(duì)MPP+、谷氨酸（glutamte, Glu）和LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護(hù)作用目的：確證并量化大花羅布麻葉的抗氧化活性；通過小鼠原代中腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究從大花羅布麻葉中分離得到的三個(gè)單體化合物Q1、Q2、Q3，羅布麻霜（E1）和大花羅布麻葉黃酮富集物（E2），對(duì)由MPP+、Glu、LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護(hù)作用；同時(shí)分析可能的作用機(jī)制。方法：分

10、別以Fulin-Ciocalteu法進(jìn)行總酚含量測(cè)定，DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和Fe3+還原實(shí)驗(yàn)等不同方法對(duì)大花羅布麻相關(guān)藥物的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。采用羅布麻霜（E1，100、200μg/ml），大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，50、100μg/ml）；槲皮素（Q1）、羅布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）三個(gè)單體化合物5、10、20和40μM；處理于10DIV生長(zhǎng)期的小鼠中腦原代神經(jīng)細(xì)胞48h，免疫組化染色觀察上述藥物濃度對(duì)

11、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH+）表達(dá)陽性細(xì)胞DA神經(jīng)元和神經(jīng)核陽性（neural nuclei， NeuN+）細(xì)胞的影響，分析大花羅布麻葉對(duì)小鼠中腦神經(jīng)細(xì)胞的作用。同時(shí)分別以MPP+（10μM，48h），Glu（500μM，10min），LPS（150μg/ml，48h）三種物質(zhì)為誘導(dǎo)劑，處理相同培養(yǎng)期（10DIV）的小鼠中腦原代神經(jīng)細(xì)胞；以前述大花羅布麻相關(guān)藥物濃度對(duì)由MPP+，Glu，LPS誘導(dǎo)的D

12、A神經(jīng)損傷進(jìn)行干預(yù)，免疫組化染色觀察DA神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)的變化，分析大花羅布麻葉對(duì)三種物質(zhì)誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護(hù)作用。采用Fe3+還原實(shí)驗(yàn)測(cè)定MPP+誘導(dǎo)DA細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞培養(yǎng)液的總抗氧化能力，分析大花羅布麻相關(guān)藥物對(duì)抗MPP+的作用機(jī)制。以Griess試劑測(cè)定由LPS誘導(dǎo)DA細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量，分析大花羅布麻對(duì)抗LPS的作用機(jī)制。結(jié)果：三種不同的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示E1和E2以及三個(gè)單體化合物都具有顯著的抗氧化活

13、性，其中Q1的在單體化合物中活性最強(qiáng)，E2的活性強(qiáng)于E1。小鼠原代中腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大花羅布麻葉相關(guān)藥物在上述濃度下，對(duì)DA神經(jīng)和NeuN+細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用，并能夠?qū)A神經(jīng)元纖維的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用。MPP+、Glu和LPS等三種物質(zhì)對(duì)DA神經(jīng)元具有明顯的抑制作用，細(xì)胞活度顯著下降，細(xì)胞存活率約為50%；經(jīng)與大花羅布麻相關(guān)藥物共同作用后， DA神經(jīng)細(xì)胞存活率出現(xiàn)不同程度提高。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的總抗氧化實(shí)驗(yàn)和NO實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

14、大花羅布麻相關(guān)藥物能提高細(xì)胞的總抗氧化能力，并能抑制LPS導(dǎo)致的NO釋放量增多。結(jié)論：大花羅布麻葉相關(guān)藥物對(duì)小鼠中腦原代神經(jīng)細(xì)胞沒有細(xì)胞毒作用，可用于相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)；同時(shí)對(duì)由MPP+，Glu，LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，可能與抗氧化活性和抑制NO等炎癥因子釋放作用有關(guān)。
　　 3．大花羅布麻葉對(duì)MPTP型PD小鼠的DA神經(jīng)保護(hù)作用目的：以大花羅布麻葉黃酮富集物E2和槲皮素-3-O-槐糖苷為受試藥物，研究大花羅布麻葉對(duì)MP

15、TP型PD小鼠DA神經(jīng)的保護(hù)作用。方法：取MPTP（30mg/kg體重）作為小鼠（C57/Bl）PD模型制備藥物，大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，250mg/kg體重），槲皮素-3-O-槐糖苷（Q3，25mg/kg體重）作為干預(yù)藥物，先期給予干預(yù)藥物灌胃7天，第8天開始進(jìn)行模型制備，腹腔注射給藥，連續(xù)5天，累積給藥150mg/kg，同時(shí)灌胃給與干預(yù)藥物；最末一次給藥第2天進(jìn)行行為學(xué)參數(shù)測(cè)定，次日處死動(dòng)物，分離腦部?jī)蓚?cè)紋狀體進(jìn)行多巴胺含量測(cè)

16、定；取中腦進(jìn)行石蠟切片，免疫組化染色后觀察黑質(zhì)致密部（Substantia nigra， SN）病理變化和DA神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)變化。行為學(xué)參數(shù)包括小鼠自主活動(dòng)次數(shù)和爬桿實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：MPTP能夠顯著減少小鼠自主活動(dòng)次數(shù)和延長(zhǎng)爬桿時(shí)間，降低紋狀體中多巴胺含量，黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增多。給予大花羅布麻兩個(gè)相關(guān)藥物干預(yù)后，Q3組顯示出具有對(duì)抗MPTP產(chǎn)生的PD樣癥狀，能夠改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，增加紋狀體中多巴胺含量，同時(shí)黑質(zhì)中受損的

17、神經(jīng)細(xì)胞有所減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生程度減輕。而E2組在相同實(shí)驗(yàn)條件下，沒有顯示出明顯的保護(hù)作用。結(jié)論：大花羅布麻葉中分離得到的槲皮素-3-O-槐糖苷對(duì)MPTP型PD小鼠的DA神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)作用。
　　 本文建立了對(duì)大花羅布麻相關(guān)藥物中槲皮素-3-O-槐糖苷和羅布麻甲素同時(shí)測(cè)定的HPLC分析方法，結(jié)果顯示槲皮素-3-O-槐糖苷含量較高。采用大花羅布麻相關(guān)藥物進(jìn)行的小鼠原代中腦細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大花羅布麻沒有細(xì)胞毒作用，并能