破骨細(xì)胞與血清TRACP5b在2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠發(fā)病過程中的作用.pdf

1、目的:2型糖尿病是一種常見病和多發(fā)病,已成為世界范圍的老年健康問題。每年約有數(shù)以百萬糖尿病患者因其并發(fā)癥致殘或死亡,造成嚴(yán)重的社會及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。糖尿病性骨質(zhì)疏松是其中一種并發(fā)癥,隨著我國人口老齡化發(fā)展,其發(fā)病率逐年增加。因此如何早期診治,預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生,減少致殘、致死率,已成為世人尤以關(guān)注的社會問題。國內(nèi)外研究表明破骨細(xì)胞在糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)病機制中至關(guān)重要。破骨細(xì)胞數(shù)量和功能與糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)生密切相關(guān)。TRACP5b是破骨細(xì)胞特異性

2、標(biāo)志酶,血清TRACP水平反映體內(nèi)破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài),其特異性高,不受晝夜變化、飲食、肝腎疾病影響。本研究在建立2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型基礎(chǔ)上,通過體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)及血清TRACP5b濃度測定,觀察在不同時間正常、骨質(zhì)疏松、2型糖尿病、2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠中破骨細(xì)胞及TRACP5b變化,從細(xì)胞水平探討破骨細(xì)胞在2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。
　　 方法:2.5～3月齡雌性Wistar大鼠100只,適應(yīng)性喂養(yǎng)

3、1周后隨機分為正常對照組(NC組)24只、正常去卵巢組(NOVX組)26只、2型糖尿病組(DC組)24只、2型糖尿病去卵巢組(DOVX組)26只。組間大鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。實驗期間NC組和NOVX組常規(guī)飼料,DC組和DOVX組大鼠高糖高脂飼料(常規(guī)飼料中加入20％蔗糖、15％熟豬油、2.5％膽固醇)喂養(yǎng)8周,禁食12小時后左下腹腔給予鏈脲佐菌素(Streptozotocm,STZ),(STZ,0.1mmol/L,檸檬酸鈉配制,pH4.2

4、)30mg/kg注射。于實驗第9周末選取尾靜脈空腹血糖(FBG)≥7.Smmol/L,且伴有胰島素抵抗者作為2型糖尿病動物模型(type2diabetes mellitus,T2DM),T2DM動物模型復(fù)制成功1周后無菌條件下NOVX組和DOVX組大鼠麻醉后行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。手術(shù)當(dāng)天(0周)各組各取一只大鼠收集骨髓細(xì)胞行體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)作為基值。實驗共持續(xù)22周。第0、2、4、6、8、10、12周末各組大鼠測體重、血糖、TRACP5b

5、、胰島素；第4、8、12周末各組隨機選取一只大鼠拉頸處死。體外骨髓破骨細(xì)胞培養(yǎng):75％乙醇浸泡大鼠10～15分鐘。無菌條件下取股骨,分離周圍組織,切斷股骨兩端骨骺,用含4mlα-MEM注射器沖洗骨髓腔2次,無菌離心管收集骨髓沖洗液,離心；培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃度為1.5×106/ml,將此細(xì)胞懸液置于24孔培養(yǎng)板內(nèi),0.5ml/孔。培養(yǎng)液為α-MEM,其中含10％胎牛血清、30ng/ml sRANKL、10ng/ml M-CSF、100U/m

6、l青霉素、100 ug/ml鏈霉素；每2～3天更換培養(yǎng)液,置于5％CO2和37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。破骨細(xì)胞染色和計數(shù):細(xì)胞培養(yǎng)7天后,固定細(xì)胞,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色。TRAP染色陽性且細(xì)胞核數(shù)≥3個認(rèn)定為破骨細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下每孔計數(shù)。血清TRACP5b采用ELISA法測定。所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,計量資料多組間比較采用方差分

7、析或秩檢驗,p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1不同時間各組大鼠體重、血糖、胰島素比較結(jié)果
　　 1.1體重比較
　　 NOVX組、NC組大鼠體重均呈增加趨勢,且NOVX組大鼠因去卵巢體重增加明顯,DOVX組大鼠體重?zé)o明顯變化,DC組大鼠因糖尿病體重呈減輕趨勢。
　　 0周NC與DC、DOVX組兩兩之間無顯著差異(p>0.05),NC與NOVX之間無顯著差異(p>0.05),NO

8、VX組與DC、DOVX組之間存在顯著差異(p〈0.05),2周NOVX組體重均顯著高于其他各組(p<0.05),NC、DC、DOVX組兩兩之間無顯著差異(p>0.05)。4周DC組體重最低且與NC、NOVX組有顯著差異(p<0.05),NOVX組體重均高于其他各組且有顯著差異(p<0.05)。6周與8周任意兩組之間比較均有顯著差異(p<0.05),DC組體重最低,NOVX組體重最高。10周DC組體重均低于其余各組且有顯著差異(p<0.0

9、5),NOVX組體重均高于其余各組且有顯著差異(p<0.05)。12周NOVX組與其余各組之間比較均有顯著差異(p<0.05),DC組與NC組之間有顯著差異(p<0.05),而DOVX與DC、NC組之間無顯著差異(p>0.05)。
　　 1.2血糖比較結(jié)果
　　 0周糖尿病組(DC、DOVX)FBG顯著高于非糖尿病組(NC、NOVX)(p<0.05)。2周DC組、DOVX組FBG出現(xiàn)下降趨勢,DC組FBG顯著高于NC組、

10、NOVX組(P<0.05),DOVX組FBG顯著高于NOVX組(P<0.05),NC組FBG與NOVX組相比無顯著差異(P>0.05),DOVX組FBG高于NC組但無顯著差異(P>0.05)。4周DC組、DOVX組FBG繼續(xù)呈下降趨勢,且各組之間FBG無顯著差異(P>0.05)。6周DC組、DOVX組FBG顯著高于NC組、NOVX組(P<0.05),NC組FBG與NOVX組、DC組FBG與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)。8周

11、DC組、DOVX組FBG顯著高于NC組、NOVX組(P<0.05),FBG在NC組與NOVX組、DC組與DOVX組之間均無顯著差異(P>0.05)。10周各組之間FBG均無顯著差異(P〉0.05)。12周各組之間FBG均無顯著差異(P>0.05)。
　　 1.3胰島素比較結(jié)果
　　 0周:糖尿病組(DC、DOVX)顯著高于非糖尿病組(NC、NOVX)(p<0.05)2周:DC組顯著高于NC、NOVX、DOVX組(p<0.

12、05),NOVX組顯著低于其他三組(p<0.05)。DOVX組與NC組之間無顯著差異(p>0.05)。4周:DC組顯著高于NC、NOVX、DOVX組(p<0.05),其余各組兩兩之間比較無顯著差異(p>0.05)。6周:各組之間兩兩比較無顯著差異(p>0.05)。8周:DC、DOVX組顯著高于NOVX組(p<0.05),其余各組兩兩之間比較無顯著差異(p>0.05)。10周與12周:各組之間兩兩比較無顯著差異(p>0.05)。
　

13、　 2不同時間大鼠破骨細(xì)胞計數(shù)、血清TRACP5b比較結(jié)果
　　 2.1破骨細(xì)胞計數(shù)比較結(jié)果
　　 0周各組間比較均無顯著差異。4周與8周結(jié)果顯示DOVX組破骨細(xì)胞計數(shù)均高于其他各組,但與NOVX之間無顯著差異(p>0.05),NC組均低于其他各組(p<0.05)。12周結(jié)果顯示DC組與NOVX組之間無顯著差異(p〉0.05),NC組破骨細(xì)胞計數(shù)均明顯低于其他各組(p<0.05),DOVX組顯著高于其他各組(p<0.0

14、5)。
　　 2.2血清TRACP5b結(jié)果
　　 0周任意兩組之間比較均無顯著性差異(p>0.05)。2周NOVX組、DOVX組濃度明顯高于DC、NC組(p<0.05),NC組濃度明顯低于其他各組(p<0.05),NOVX與DOVX組之間無顯著差異(p>0.05)。4周NC組濃度明顯低于其余各組(p<0.05),NOVX組濃度顯著高于DC、DOVX組(p<0.05),DC組與DOVX組之間無顯著差異(p>0.05)。6周

15、NC組濃度顯著低于其他各組(p<0.05),NOVX組、DC組與DOVX組之間無顯著差異(p>0.05)。8周各組兩兩之間比較均無顯著差異(p〉0.05)。10周NC組濃度明顯低于其他各組(p<0.05),DC組,NOVX組,DOVX組之間無顯著差異(p>0.05)。12周DOVX組濃度均高于其他各組且有顯著差異(p<0.05),NC組、NOVX組、DC組之間無顯著差異(p>0.05)。
　　 3相關(guān)分析結(jié)果
　　 3.

16、1破骨細(xì)胞計數(shù)與血清TRACP5b相關(guān)分析結(jié)果破骨細(xì)胞數(shù)量與血清TRACP5b濃度呈正相關(guān)(r=0.789,p<0.000)。
　　 3.2骨細(xì)胞數(shù)量、血清TRACP5b濃度與血糖相關(guān)分析結(jié)果
　　 破骨細(xì)胞數(shù)量與血糖水平無相關(guān)性(r=-0.290,p=0.275),血清TRACP5b濃度與血糖無相關(guān)性(r=-306,p=0.249)。
　　 結(jié)論:
　　 12型糖尿病和切除卵巢均促進(jìn)骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成

17、,破骨細(xì)胞數(shù)量增加可能是2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠骨量丟失的因為之一；
　　 22型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠血清TRACP5b濃度較正常對照組顯著升高,為早期監(jiān)測糖尿病骨質(zhì)疏松、預(yù)防其發(fā)生提供依據(jù)；
　　 32型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中,破骨細(xì)胞數(shù)量和血清TRCP5b濃度不隨病程延長而改變,保持在相對穩(wěn)定狀態(tài)；
　　 4破骨細(xì)胞數(shù)量與血清TRACP5b濃度呈正相關(guān)；
　　 5破骨細(xì)胞數(shù)量、血清TRACP5b濃度