刺參5-HT4R活性特征及生理功能初探.pdf

1、刺參又稱作仿刺參（Apostichopus japonicus），屬于海參綱（Holothuroidea）刺參科（Stichopodidae），是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)物種。自上世紀(jì)80年代起，人工養(yǎng)殖就已經(jīng)取得突破。但在養(yǎng)殖過程中，夏眠導(dǎo)致刺參體重下降的問題嚴(yán)重影響其養(yǎng)殖產(chǎn)量，揭示刺參夏眠調(diào)控過程及其機(jī)制是解決這一問題的關(guān)鍵。血清素是重要的單胺類神經(jīng)激素，血清素受體(serotonin receptor,5-HTR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體

2、，在動物的攝食調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本文開展刺參血清素受體Aj5-HTR基因克隆和序列特征分析、亞細(xì)胞定位和受體類型鑒定、在夏眠周期中變動規(guī)律及在代謝調(diào)控中的功能等方面的研究，初步探討了Aj5-HTR在刺參攝食代謝中的調(diào)控作用和機(jī)制。主要取得的研究結(jié)果如下:
　　采用RACE克隆技術(shù)獲得了j5-HT4R的全長序列，并對其基因序列特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，Aj5-HT4R cDNA序列(KX583229)全長1，544 bp，包含2

3、33 bp的5'UTR，1，011 bp的ORF和300 bp的3'UTR，可編碼336個氨基酸。和其他G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)一樣，j5-HTR具有典型的七次跨膜結(jié)構(gòu)。并利用系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，血清素受體明顯分為六支:5-HTR1亞型，5-HTR2亞型，5-HTR4亞型，5-HTR5亞型，5-HTR6亞型，及5-HTR7亞型受體。Aj5-HT4R和5-HTR4聚為一支，與棘皮類動物紫海膽5-HTR4-like相似性為40％。
　　通過

4、熒光定量PCR基因表達(dá)定量檢測分析了Aj5-HT4R在不同夏眠時期刺參組織中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，Aj5-HT4R基因在刺參不同組織器官中廣泛表達(dá)。刺參夏眠期間Aj5-HT4R在消化道、肌肉及呼吸樹等組織中基因表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的下降，其中呼吸樹中下降極顯著。利用刺參活體生理實驗，初步檢測了5-HT作用下刺參呼吸樹、消化道、肌肉中糖代謝相關(guān)的磷酸果糖激酶AjPFK的表達(dá)量。結(jié)果顯示，相對于對照組（注射磷酸緩沖液），5-HT注射組在肌肉組

5、織中的AjPFK表達(dá)量有顯著升高(P＜0.05)。結(jié)合上述研究結(jié)果，說明5-HT及其受體5-HTR與刺參夏眠代謝調(diào)控存在關(guān)系。
　　利用細(xì)胞生物學(xué)研究方法，對Aj5-HT4R受體性質(zhì)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。利用構(gòu)建好的Aj5-HT4R-EGFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，用熒光染料DiI染膜、DAPI染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Aj5-HT4R主要定位在細(xì)胞膜上，與j5-HT4R序列中存在七次跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相一致，

6、表明Aj5-HT4R是一個膜受體，為下一步研究驗證其功能奠定了基礎(chǔ)。另一方面，通過一定濃度梯度的5-HT刺激轉(zhuǎn)染有Aj5-HT4R-EGFP表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞，結(jié)果顯示Aj5-HTR在一定濃度（0、100pM、10nM、1μM）配體刺激下出現(xiàn)內(nèi)吞。為深入揭示j5-HT4R在刺參夏眠調(diào)控中的功能及其作用機(jī)制，我們運用細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究平臺，將構(gòu)建的Aj5-HT4R-Flag轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，檢測5-HT作用下Aj5-HT4R