東亞鉗蝎粗毒純化組分對Lewis肺癌瘤源小鼠體內(nèi)腫瘤的影響.pdf

1、背景：惡性腫瘤是當(dāng)前一個(gè)全球性問題，是嚴(yán)重威脅人民健康和生命的多發(fā)病、常見病，世界各國均投入大量人力和物力進(jìn)行腫瘤的研究。 用藥物治療腫瘤有悠久的歷史，癌癥的化學(xué)治療作為一門較系統(tǒng)和獨(dú)立的學(xué)科是從20世紀(jì)40年代初逐漸發(fā)展和建立起來的。隨著生物學(xué)、生物化學(xué)和研究方法的改進(jìn)，同時(shí)為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)腫瘤治療的不足，越來越多的中外科學(xué)工作者把目光轉(zhuǎn)向了一個(gè)頗具特色的領(lǐng)域——生物毒素的抗癌研究[1]。目前研究較多的是蛇毒、蝎毒以及蟾蜍毒等。人

2、們試圖從中分離出具有抗癌活性的組分，用于研制新的抗腫瘤藥物以克服現(xiàn)有藥物的毒副作用及腫瘤耐藥性。 目前認(rèn)為蝎毒是全蝎發(fā)揮藥理作用的重要成分。由于蝎毒粗毒(ScorpionVwnomCrude，SVC)成分較為復(fù)雜，毒、副作用明顯，并且不同種屬或者同種屬不同來源及不同的取毒條件等因素所造成的多種差異，不能直接用于基礎(chǔ)及臨床研究，故國內(nèi)外的研究大都是把蝎毒分離純化后進(jìn)行的。純化后的蝎毒抗癌多肽經(jīng)實(shí)驗(yàn)對多種腫瘤具有明顯抑瘤作用，且有良

3、好的免疫調(diào)節(jié)功能，與放療藥和化療合用可降低放療和化療的毒副作用，另外還可能增加了腫瘤組織對射線的敏感性，因此，其具有成為新型抗癌中藥的良好前景，而蝎毒分離多肽很可能是蝎毒中的一種有效、低毒的抗腫瘤成分。 蝎毒成分復(fù)雜且功能各異，各成分中有對腫瘤細(xì)胞起抑殺作用，也有對正常細(xì)胞殺傷的，而且其機(jī)制目前尚未有完全明晰，本實(shí)驗(yàn)將東亞鉗蝎蝎毒粗毒成分進(jìn)行多次分離純化，篩選其中高效的蝎毒成分，觀察其對腫瘤的影響，只有成分確定，純度高，才有可能

4、客觀研究其作用的效果以及機(jī)制。 目的：本次實(shí)驗(yàn)將東亞鉗蝎蝎毒通過分離純化后提取其中的抑癌成分，減少其中可能致過敏和毒性成分，觀察其對Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠腫瘤生長、生存期、肺部轉(zhuǎn)移以及腫瘤抑制率的影響。 方法： 一、東亞鉗蝎蝎毒多肽的分離純化及其組分的抗腫瘤效果篩選研究 1.應(yīng)用凝膠層析法對蝎毒粗毒進(jìn)行分離純化，主要采用SephadexG-50進(jìn)行分子篩分離成7個(gè)組分，本次分離純化與本研究所趙燦

5、國[2]論文所述的步驟與結(jié)果重復(fù)性高，而該論文中對分離的組分已進(jìn)行了對人骨髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60、人肺癌A549細(xì)胞、人低分化胃腺癌細(xì)胞BGC-823和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的MTT抑制率篩查，其中發(fā)現(xiàn)第Ⅴ組分對A549腫瘤細(xì)胞抑制率最高的組分，故選之進(jìn)行SephadexG-25脫鹽并分別凍干保存。 2.將其中第Ⅴ組分以CMSephadexC-50陽離子交換樹脂進(jìn)行進(jìn)一步分離，剃度式洗脫出各個(gè)組分，將各組分以Sepha

6、dexG-25進(jìn)行脫鹽，然后凍干保存。 3.抗腫瘤活性篩選：將以上分離的組分，應(yīng)用MTT法進(jìn)行蝎毒粗毒進(jìn)行抗腫瘤篩選工作，主要是對人肺癌細(xì)胞A549，篩選出其中抗腫瘤活性最高的組分。 二、東亞鉗蝎蝎毒抗腫瘤組分對Lewis肺癌瘤源小鼠體內(nèi)腫瘤影響及其機(jī)制探討 1.測定已篩選的東亞鉗蝎蝎毒組分的半數(shù)致死量LD50以確定Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的劑量。取昆明種小鼠，18-22g,雌雄各半，腹腔注射由(

7、1mg/ml-0.062mg/ml)¨個(gè)劑量，應(yīng)用電腦統(tǒng)計(jì)軟件DASver1.0(DrugAndStatisticsforWindows)Bliss法(正規(guī)LD50計(jì)算)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，高劑量采用組分LD50的1/7，低劑量是1/15。 2.蝎毒組分對Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠生存期和腫瘤生長狀況的影響實(shí)驗(yàn)：選擇近交系C57BL/6小鼠48只，雌性，6周齡，體重16～18g，右腋下接種LLC細(xì)胞懸液0.2ml(含細(xì)胞數(shù)2×1

8、06個(gè))建立肺轉(zhuǎn)移模型。第7d腫瘤體表可觸及時(shí)，用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為組，分別為①空白組，②高劑量、③低劑量、④順鉑組，開始用藥后隔天觀察體重，定期觀察外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)；觀察各組的生存期，定期測量腋下腫瘤的體積變化。 3.將上面實(shí)驗(yàn)效果較好的組分再進(jìn)行腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)，并加入與順鉑協(xié)同作用的一組。開始用藥后隔天觀察體重，定期觀察外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)；定期測量腋下腫瘤的體積變化。種植腫瘤后21天將所有小鼠引頸處死，測量瘤重，鼠重，肺轉(zhuǎn)移結(jié)

9、節(jié)數(shù)量，肺、脾重量以及腫瘤的石蠟切片，HE染色觀察，TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡比率。 結(jié)果： 1、東亞鉗蝎粗毒經(jīng)SephadexG-50分離可得到7個(gè)組分，其中抗腫瘤的重要組分第Ⅴ組分脫鹽凍干保存后，進(jìn)行CMSephadexC-50陽離子交換分離以及分別凍干，原粗毒共提取13種可能有腫瘤抑制作用的組分包括：Ⅳ、Ⅴ、Ⅴ-Ⅰ-Ⅱ、Ⅴ-Ⅱ-Ⅰ-②、Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-②、Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-③、Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①、Ⅴ-Ⅱ-Ⅳ-①、Ⅴ-Ⅱ-Ⅴ-

10、①、Ⅴ-Ⅲ-Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ需進(jìn)一步篩選。 2、MTT篩選以上對腫瘤細(xì)胞抑制最強(qiáng)的兩種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)組分Ⅴ-Ⅱ-Ⅱ-②和Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①，(下面將其簡化為A和B組分)，(A)組分在10ug/ml時(shí)對A549細(xì)胞有18.93％的抑制率，(B)組分在1ug/ml時(shí)對A549細(xì)胞有14.81％的抑制率。 3、(A)和(B)LD50值經(jīng)過測定后得到分別為(A)LD50=3.736±0.234mg/kg和(B)LD50=3.523±0.3

11、17mg/kg 4、Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠生存期和腫瘤生長狀況的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，(A)組分高、低劑量對腫瘤體積抑制率為分別為10.29％和9.35％，而(B)組分則分別為12.35和11.25％；在最后一天測得白細(xì)胞計(jì)數(shù)，(A)組分高、低劑量分別為82.36和85.23％，(B)組分能有效的恢復(fù)白細(xì)胞水平到接近正常水平95.37％和93.67％，而空白組和順鉑組的骨髓抑制情況嚴(yán)重，分別降低至正常水平的65.37％和35.

12、28％。 5、選用上面實(shí)驗(yàn)效果良好的B組分進(jìn)行動(dòng)物腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)(B)組分能有效的與順鉑起協(xié)同腫瘤抑制作用，腫瘤重量和TUNEL法測凋亡指數(shù)比較，較單用順鉑組分別提高10.32％和11.74％，金氏方程顯示q＞1，兩藥有協(xié)同作用；，同時(shí)協(xié)同組腫瘤肺轉(zhuǎn)移率明顯優(yōu)于順鉑組，組間配對t檢驗(yàn)，p＜0.05。結(jié)論： ①東亞鉗蝎蝎毒分離組分Ⅴ-Ⅱ-Ⅲ-①有一定的Lewis肺癌腫瘤的抑制作用。 ②提高荷瘤小鼠生存期以及恢復(fù)