HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷SiHa細(xì)胞SCID鼠的免疫功能的影響及宮頸癌發(fā)生過程中免疫逃逸機(jī)制的研究.pdf

1、宮頸癌的發(fā)生率為婦科惡性腫瘤之首，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤第二位。目前對宮頸癌的治療包括放療、手術(shù)、化療等，但仍有大量的患者復(fù)發(fā)而死亡，而對那些復(fù)發(fā)病例的治療效果相對較差，因此，需要尋求新的治療手段。大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)宮頸癌與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)，并以HPV16最為常見。HPVE6和E7持續(xù)表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞，具有免疫原性，是免疫治療理想的靶抗原。與活的或重組疫苗比較，多肽疫苗可特異地直接針對免疫系統(tǒng)的特異免疫表位。多肽疫苗

2、安全，相對易于臨床生產(chǎn)，對較少的免疫表位誘發(fā)特異的免疫應(yīng)答，疫苗治療的在于提高針對E6和E7病毒蛋白的細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而清除HPV感染的細(xì)胞。但目前尚不能體外培養(yǎng)HPV，而且HPV具有嚴(yán)格的種族特異性，限制了HPV動(dòng)物模型的使用。以細(xì)胞和體液嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷為特征SCID鼠的發(fā)現(xiàn)，在SCID鼠體內(nèi)人免疫功能重建的成功，實(shí)現(xiàn)了在動(dòng)物體內(nèi)研究人類免疫細(xì)胞和人類腫瘤的關(guān)系。 雖然有跡象表明在免疫抑制的患者中，宮頸腫瘤的發(fā)生率明顯增高，

3、但是HPV相關(guān)腫瘤發(fā)病過程中免疫應(yīng)答所起的作用并不清楚。盡管已有多種宮頸癌HPV疫苗研發(fā)的報(bào)道，其中部分已進(jìn)入臨床驗(yàn)證，但從現(xiàn)有資料來看，大多療效不盡如人意。究其原因與腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫監(jiān)視有密切關(guān)系。這種免疫逃逸是由于腫瘤細(xì)胞所行使的防御機(jī)制和/或宿主免疫系統(tǒng)功能受損，可以歸納為兩種機(jī)制即腫瘤細(xì)胞的被動(dòng)免疫逃逸和腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)攻擊。 腫瘤細(xì)胞被動(dòng)免疫逃逸的機(jī)制主要為腫瘤細(xì)胞缺乏共刺激分子和低表達(dá)MHC分子。MHC-Ⅰ類分子在

4、腫瘤細(xì)胞的免疫識別和效應(yīng)過程中起著重要作用。CD99可調(diào)節(jié)MHC-Ⅰ類分子從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面的表達(dá)。HLA-G是一種非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類抗原，可能是腫瘤免疫逃逸的機(jī)制之一。目前對MHC-Ⅱ類分子異常表達(dá)的生理和病理學(xué)意義還不清楚。 腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)攻擊是指腫瘤細(xì)胞可以通過對自身表面分子的表達(dá)的改變來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，使機(jī)體的全身免疫功能及局部免疫功能受到抑制。腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL，與Fas結(jié)合，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞進(jìn)入凋亡，被認(rèn)

5、為與人類腫瘤的“免疫反擊”。 為此，我們以接種SiHa細(xì)胞株(表達(dá)HPV16)的人免疫重建SCID鼠為研究對象，在國內(nèi)外首次建立免疫重建荷人HPV16陽性宮頸癌SCID鼠模型，繼以HPV16E7多肽疫苗輔以T輔助細(xì)胞免疫表位，乳化于IFA中接種于SCID鼠，觀察其生物學(xué)特性及其對免疫功能的影響；并研究宮頸癌發(fā)生過程中免疫調(diào)節(jié)分子HLA-DR、CD99和HLA-G所起的作用，了解被動(dòng)免疫逃逸機(jī)制在宮頸癌發(fā)生中的作用；通過檢測Fas

6、、FasL和c-FLIP在正常宮頸、CIN和宮頸鱗癌中的表達(dá)，了解Fas/FasL途徑在宮頸癌發(fā)生中作用，旨在提高HPV疫苗的臨床療效。 第一部分HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞SCID鼠免疫功能的影響目的觀察HPV16E7多肽疫苗對人免疫重建荷人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)鼠移植瘤的影響。方法對SCID鼠腹腔注射人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)后24小時(shí)，皮下接種HPV16陽性的

7、人宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞，建立人免疫重建荷SiHa細(xì)胞的SCID鼠模型，當(dāng)移植瘤最小體積達(dá)100mm3時(shí)，三次背部皮下接種疫苗，每次接種間隔二周，觀察荷瘤鼠一般生物學(xué)特性，檢測血漿中人IgG含量、外周血中人CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞、脾重、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)以及脾細(xì)胞毒殺傷功能。實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白組，僅為腹腔內(nèi)注射PBL，疫苗成份僅為不完全佐劑(IFA)；隨機(jī)多肽組，為腹腔內(nèi)注射PBL，皮下接種SiHa細(xì)胞，疫苗成份僅為隨機(jī)

8、多肽+T輔助多肽+IFA；T輔助多肽組，為腹腔內(nèi)注射PBL，皮下接種SiHa細(xì)胞，疫苗成份僅為T輔助多肽+IFA；多肽治療組，為腹腔內(nèi)注射PBL，皮下接種SiHa細(xì)胞，疫苗成份為HPV16E711-20(YMLDLQPETT)，HPV16E7s6-93(TLGIVCPI)+T輔助多肽+IFA。結(jié)果各組SCID鼠血漿中人IgG水平，8周內(nèi)隨重建時(shí)間延長而升高(P＜0.05)，多肽治療組達(dá)2957.85μg/ml，但各組間無顯著性差異；外周

9、血中均可檢測到人CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞，但各組間無顯著性差異(P＞0.05)；與空白組比較，其他三組SCID鼠脾重均顯著增加(P＜0.05)。組織學(xué)觀察到移植瘤局部TIL浸潤及明顯的出血和壞死，但經(jīng)免疫組化未檢測到人CD8+T細(xì)胞。與空白組比較，多肽治療組、隨機(jī)多肽組、輔助多肽組的脾細(xì)胞毒殺傷功能均顯著降低(P＜0.05)。結(jié)論人免疫功能重建的荷SiHa細(xì)胞的SCID鼠體內(nèi)重建的人免疫功能隨荷瘤時(shí)間的延長受到抑制，多肽疫苗在

10、一定程度上能減輕免疫抑制狀態(tài)。 第二部分子宮頸癌發(fā)生過程中被動(dòng)免疫逃逸機(jī)制的研究目的研究宮頸癌發(fā)生過程中細(xì)胞膜分子HLA-DR、HLA-G和CD99的作用。方法應(yīng)用特異性抗體HLA-DR、HLA-G和CD99，用免疫組化方法檢測19例正常宮頸組織、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宮頸鱗癌中HLA-DR、HLA-G和CD99蛋白的表達(dá)，并檢測Ki67的表達(dá)情況。結(jié)果在正常宮頸和CIN中，除了3例CINⅢ外，均不

11、表達(dá)HLA-DR，在宮頸鱗癌組織中，中分化和低分化鱗癌HLA-DR的表達(dá)顯著高于高分化鱗癌(P＜0.05)。所有正常宮頸標(biāo)本均呈HLA-G強(qiáng)表達(dá)，陽性顆粒位于宮頸鱗狀上皮和宮頸管內(nèi)的柱狀上皮。只有小部分CINs和SCCs表達(dá)HLA-G，與正常對照組比較，CINs和SCCs中HLA-G的表達(dá)顯著降低(P＜0.001)。SCCs中CD99的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織(P＜0.01)和CINs(P＜0.05)。所有標(biāo)本均可見Ki67陽性染色細(xì)胞

12、。在SCCs和CINs中，Ki67的表達(dá)顯著高于正常對照組(P＜0.001)，但SCCs和CINs間Ki67的表達(dá)無顯著性差異。結(jié)論HLA-DR和CD99表達(dá)增高可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。 第三部分子宮頸癌發(fā)生過程中主動(dòng)免疫攻擊機(jī)制的研究目的檢測凋亡相關(guān)抗原Fas、FasL和cFLIP在宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)方式，研究Fas介導(dǎo)的凋亡在宮頸癌發(fā)生中的作用。方法應(yīng)用特異性抗體Fas、FasL和cFLIP，用免疫組化方法檢測19例正常宮頸組

13、織、15例CINI、22例CINⅡ、23例CINⅢ和34例宮頸鱗癌中Fas、FasL和cFLIP蛋白的表達(dá)，并用TUNEL檢測所有標(biāo)本中凋亡指數(shù)。結(jié)果在CINⅠ、CINⅡ和正常宮頸，F(xiàn)as的表達(dá)無顯著性差異；在宮頸中分化鱗癌中，F(xiàn)as的表達(dá)高于CINⅢ和宮頸高分化鱗癌，而宮頸低分化鱗癌中，F(xiàn)as的表達(dá)低于宮頸中分化鱗癌，但均未達(dá)到顯著性差異。在CINs中幾乎不表達(dá)FasL，但隨著腫瘤分化程度的下降，F(xiàn)asL的表達(dá)顯著增加。從正常宮頸→C

14、INs→宮頸癌，cFLIP的表達(dá)逐漸增高，并隨分化程度的下降，cFLIP的表達(dá)呈增高趨勢，但不同分化程度間的表達(dá)，差異無顯著性。從正常宮頸到宮頸鱗癌，凋亡指數(shù)呈下降趨勢(p＜0.05)。在SCCs中行各指標(biāo)間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Fas的表達(dá)與cFLIP呈正相關(guān)(r=0.423，p=0.000)，而cFLIP的表達(dá)與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.499，p=0.000)。結(jié)論Fas/FasL系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常和宮頸鱗癌中cFLIP的表達(dá)增加，可能是