MiRNA-181通過靶向IFn-γ調(diào)控T細胞功能在移植物抗宿主病發(fā)生中的機制研究.pdf

1、本文對MiRNA-181通過靶向IFN-γ調(diào)控T細胞功能在移植物抗宿主病發(fā)生中的機制進行了研究。本研究分為三個部分：
　　第一部分：T細胞功能相關的候選miRNAs以及細胞因子在異基因造血干細胞移植患者中的差異性表達的分析。
　　目的：探討異基因造血干細胞移植術(allo-HSCT)后伴有及不伴有急性移植物抗宿主病(aGVHD)的患者外周血CD4+T細胞及血漿中8個候選miRNAs的差異性表達情況及相關細胞因子表達情況分析。

2、
　　方法：8個待選miRNAs差異性表達分析:選擇健康志愿者作為對照，并參照aGVHD評分標準，選擇異基因造血干細胞移植術后100天內(nèi)無aGVHD以及發(fā)生Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度aGVHD的患者，通過熒光定量PCR技術檢測不同實驗組外周血CD4+T淋巴細胞和血漿中8個待選的miRNAs的差異性表達情況。通過細胞因子檢測試劑盒分析不同實驗組細胞因子差異性表達。
　　結(jié)果：與對照組相比，在aGVHD組有4個miRNAs出現(xiàn)了差異性表達，其

3、中，miR-150和miR-181a明顯下調(diào)（P＜0.05），miR-155和miR-92b明顯上調(diào)（P＜0.05）;而miR-17，miR-92a，miR-146a以及miR-146b的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;患者血漿中miRNAs的表達水平和上述淋巴細胞中的表達情況一致的。此外，通過ELISA檢測不同實驗組血漿中細胞因子的表達差異，在aGVHD患者中，IL-2、IFN-γ、TNF和IL-17A的分泌水平明顯上調(diào)（P＜0

4、.05），其中IL-2，IFN-γ，TNF與aGVHD的程度呈正相關。IL-10和IL-4的分泌水平明顯下調(diào)(P＜0.05)，其中IL-10與aGVHD輕重程度呈負相關性;而IL-6的分泌水平未見明顯變化;在未發(fā)生aGVHD患者組中，IL-2、IFN-γ和TNF分泌水平明顯下調(diào)（P＜0.05），而IL-10、IL-4、IL-17A和IL-6的分泌水平未見明顯變化（P＞0.05），aGVHD發(fā)生之前各細胞因子水平均未見明顯變化（P＞0.0

5、5）。在發(fā)生aGVHD患者中，miR-181a和miR-150的表達水平明顯下調(diào)，并且和aGVHD的嚴重程度呈負相關（P＜0.05），miR-155的表達水平明顯上調(diào)，并且和aGVHD的嚴重程度呈正相關(P＜0.05)，miR-92b的表達水平則明顯上調(diào)(P＜0.05)。此外，在GVHD發(fā)生≥4前，miR-181a，miR-150，miR-155以及miR-92b的表達水平已經(jīng)開始明顯改變。
　　結(jié)論：miR-181a，miR-1

6、50，miR-155和miR-92b在aGVHD發(fā)生中存在差異性表達;Th1免疫應答是導致aGVHD發(fā)生的主要效應機制，miRNAs和細胞因子的表達水平與aGVHD的發(fā)生程度均有相關性;差異性表達的miRNAs可以用于預測aGVHD的發(fā)生。
　　第二部分：mi R-181a對CD4+T淋巴細胞功能影響、作用機制的體外研究及靶基因的篩選、鑒定。
　　目的：對候選miRNAs進行的靶基因預測、篩選和鑒定;探討miRNA對CD4+

7、T淋巴細胞功能影響及其可能的作用機制。
　　方法：通過生物信息學分析，篩選miRNA潛在的靶基因，通過qRT-PCR、Western blot及熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定候選miRNAs的靶基因。通過三質(zhì)粒系統(tǒng)進行慢病毒包裝，構(gòu)建表達miRNA前體的慢病毒（LV-miRNA）及空載體(LV-Ctrl)，感染正常人初始CD4+T細胞，實時定量PCR技術檢測miRNA在CD4+T細胞中的相對表達量;通過流式細胞術對IFN-γ、IL-17

8、A、IL-4以及Foxp3進行檢測，以評價各亞群細胞的比例;通過CCK-8及AnnexinⅤ/7-AAD檢測細胞的增殖及凋亡情況，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子分泌的情況;此外，通過制備過表達miR-181a的慢病毒載體，以不同的病毒滴度感染一定數(shù)量的CD4+T細胞，然后評價IFN-γ的表達水平。
　　結(jié)果：通過生物信息學分析篩選miR-181a的潛在的19個靶基因，其中包括IFN-γ在內(nèi)的5個靶基因是明顯下調(diào)的;熒光素酶報

9、告基因?qū)嶒炞C實，感染miR-181a后，IFN-γ-WT的熒光活性明顯減低而IFN-γ-mu無明顯改變。進一步通過CD4+T細胞過表達miR-181a后IFN-γ的基因mRNA水平未見明顯變化，而蛋白水平較空白對照組及空載體對照組明顯下降，且其水平與miR-181a的水平呈負相關(P＜0.05);成功構(gòu)建了表達miR-181a前體的慢病毒載體并感染CD4+T細胞，miR-181a表達量升高約4倍（P＜0.05）;通過流式對T細胞亞群分析

10、提示，相較于對照組，LV-181a組Th1細胞比例明顯減少，Th2及Treg細胞比例增高，Th17無明顯變化;CCK-8檢測顯示LV-miR-181a組細胞增殖活性減低（P＜0.05），AnnexinⅤ/7-AAD檢測顯示LV-miR-181a組凋亡細胞比例增加(P＜0.05)。ELISA顯示LV-miR-181a組細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-17A分泌減少(P＜0.05)、IL-4分泌顯著增加（P＜0.05）;此外，隨著miR-1

11、81a濃度的遞增，IFN-γ的mRNA水平無差異性變化，但是通過對IFN-γ的蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)其表達水平遞減，與miR-181a濃度呈負相關。
　　結(jié)論：MiR-181a通過靶向IFN-γ調(diào)控CD4+T淋巴細胞功能;miR-181a對CD4+T淋巴細胞的功能調(diào)控具有濃度依賴性。
　　第三部分：miR-181b在小鼠異基因造血干細胞移植模型中，對急性移植物抗宿主病發(fā)生的影響。
　　目的：探討miRNA在小鼠體內(nèi)對急性移

12、植物抗宿主病發(fā)生的作用。
　　方法：通過qRT-PCR、Western blot及熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定在小鼠體內(nèi)相應miRNAs對靶基因的靶向作用。獲取轉(zhuǎn)染LV-miR-181b的供鼠脾臟淋巴細胞和骨髓細胞，分別以尾靜脈注射LV-miR-181b、LV-Ctrl和PRIM1640培養(yǎng)基的C57BL/6小鼠為供鼠，qRT-PCR檢測供鼠脾臟及骨髓細胞中miR-181b的表達;建立異基因造血干細胞移植模型，以BALB/c小鼠為受鼠

13、，分別取各種供鼠脾臟及骨髓單個核細胞尾靜脈注射入受鼠，行異基因造血干細胞移植，觀察移植后各組小鼠生活狀態(tài)、體重變化并監(jiān)測造血重建情況，參照aGVHD臨床評分標準對各組小鼠aGVHD發(fā)生情況進行綜合評分，對小鼠肝臟、小腸等臟器進行病理學檢測，參照aGVHD病理學評分標準進行評分，通過ELISA技術及流式細胞術檢測不同實驗組小鼠血漿中細胞因子及脾細胞Th細胞亞群的變化。
　　結(jié)果：通過GeneBank等數(shù)據(jù)庫比對，我們發(fā)現(xiàn)miR-18

14、1a在人、鼠中同源，其成熟序列相同，qRT-PCR結(jié)果顯示，與尾靜脈注射LV-Ctrl和PRIM1640培養(yǎng)基供鼠相比，注射LV-miR-181a的供鼠脾臟單個核細胞miR-181a的表達量升高約2.48倍（P＜0.05），骨髓單個核細胞miR-181a的表達無明顯變化。移植后，供鼠尾靜脈注射miR-181a（即LV-miR-181a移植組）的受鼠體內(nèi)IFN-γ mRNA的蛋白及基因水平均未見明顯改變，通過進一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C

15、實，在小鼠體內(nèi)miR-181a對IFN-γ不產(chǎn)生作用。進一步的生物信息學分析及熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實在小鼠內(nèi)miR-181b和miR-181d而非miR-181a和miR-181c靶向IFN-γ的3'UTR。在小鼠體內(nèi)過表達miR-181b后，通過實時定量PCR和Western blot技術分別檢測IFN-γ的表達水平，結(jié)果提示IFN-γ的蛋白水平明顯下降(P＜0.05)而基因水平未見明顯改變（P＞0.05），證實了在小鼠體內(nèi)，是mi

16、R-181b靶向小鼠IFN-γ基因;在小鼠移植模型中，細胞因子檢測結(jié)果提示，相比較于TBI組，GVHD組的Th1細胞的數(shù)量明顯增高(P＜0.05)，而IFN-γ，IL-2和TNF的水平明顯增加（P＜0.05），相同的時間點miR-181b變化提前于aGVHD的發(fā)生;鼠內(nèi)過表達miR-181b可以減少Th1細胞應答并阻止aGVHD發(fā)生:在小鼠體內(nèi)過表達miR-181b后，實時定量PCR檢測其表達升高約4倍，并且miR-181b過表達組aG