Urocortin對抗糖尿病腎病的發(fā)展及其機(jī)制研究.pdf

1、高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的過度生成是包括糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN）在內(nèi)的糖尿病并發(fā)癥的最主要的分子學(xué)機(jī)制。在2型糖尿病狀態(tài)下內(nèi)皮依賴的血管舒張作用受到損害。腎小球胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)過度生成和降解障礙導(dǎo)致EcM沉積。Urocortin(UCN)是一個(gè)40個(gè)氨基酸的多肽，屬于促腎皮質(zhì)激素釋放激素(cort

2、icotrophin releasing factor,CRF)家族的一員。UCN抑制內(nèi)皮細(xì)胞活性氧族的釋放，誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴的大鼠冠狀動脈的舒張；抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，下調(diào)VEGF表達(dá)；誘導(dǎo)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、合包體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase，MMP-9)，后者與基質(zhì)降解密切相關(guān)。這些報(bào)道提示UCN可能與DN的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)聯(lián)。 本文采用腎小球系膜細(xì)胞(mesang

3、ial cell，MC)作為離體研究模型，db/db鼠和鏈佐星-弗氏完全佐劑(streptozotocin-complete Freund’Sadjuvant，STZ-CFA)聯(lián)合誘導(dǎo)的DN模型作為整體動物模型，研究了UCN對抗DN發(fā)展的作用及可能的作用機(jī)制。 本文的第一部分采用了體外糖基化終產(chǎn)物(advanced glycationend products，AGEs)生成實(shí)驗(yàn)和MC作為研究對象，研究了UCN對AGEs生成及高糖

4、/AGEs作用下MC增殖、組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅳ型膠原(c01lagen type Ⅳ，colla Ⅳ)表達(dá)的影響，及對TGF-β1作用下血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelium growth factor,VEGF)分泌的影響。以熒光法測定AGEs

5、的生成，3H-TDR摻入法測定細(xì)胞增殖狀態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法測定TGF-β1、CTGF、colla Ⅳ的表達(dá)，ELISA測定VEGF的分泌。結(jié)果表明，UCN對AGEs生成沒有明顯影響，但可以抑制高糖/AGEs誘導(dǎo)的MC的異常增殖和TGF-β1、CTGF、collaⅣ的過度表達(dá)和TGF-β1誘導(dǎo)的VEGF過度分泌。而CRY受體阻斷劑astressin(AS)能減弱UCN的上述作用。 本文第二部分研究了UCN對db/db鼠腎病動物模型

6、DN發(fā)展的影響。 采用公認(rèn)的2型DN模型db/db鼠為研究對象，給藥六周，連續(xù)監(jiān)測了UCN對血糖、體重、進(jìn)食量的影響，并檢測了UCN對db/db鼠血漿胰島素、尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Crea)、AGEs、紅細(xì)胞內(nèi)山梨醇(sorbitol，SB)含量、腎組織勻漿中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde

7、，MDA)水平的影響及對腎組織病理學(xué)、腎小球ECM沉積的影響。結(jié)果表明，UCN對模型動物血糖、進(jìn)食量、血漿胰島素水平?jīng)]有明顯影響，但從給藥第三周起能夠降低模型動物體重，并且能降低血漿BUN、Crea、AGEs水平、紅細(xì)胞內(nèi)SB含量、腎勻漿中MDA含量，提高腎勻漿中SOD活性，減輕腎小球病理變化及腎小球系膜基質(zhì)聚積和系膜區(qū)擴(kuò)張。AS除不能對抗UCN降低紅細(xì)胞內(nèi)SB含量的效應(yīng)外，可逆轉(zhuǎn)UCN對抗db/db鼠腎病發(fā)展的保護(hù)作用。 本文

8、第三部分研究了UCN對STZ-CFA聯(lián)合誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠DN發(fā)展的影響。采用STZ-CFA聯(lián)合誘導(dǎo)輔以高脂飲食，連續(xù)喂養(yǎng)14周制作DN模型。連續(xù)給藥8周(自實(shí)驗(yàn)開始第7周起給藥)，監(jiān)測UCN對體重、血糖的影響；生化檢測UCN對血清血糖、胰島素(放免)、BUN、Crea、總膽固醇、HDL-膽固醇、LDL-膽固醇、SOD、MDA水平的影響，收集24 h尿液，測定尿液體積、尿液中Crea、尿素氮、尿微量白蛋白(放免)水平，計(jì)算肌酐清除率；

9、觀察了UCN對腎臟病理組織學(xué)的影響及對系膜基質(zhì)聚積的影響；免疫組織化學(xué)方法研究了腎小球TGF-β1、CTGF、VEGF的表達(dá)，RT-PCR方法檢測腎組織VEGF mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，UCN對DN大鼠血糖、胰島素、體重沒有明顯影響，但減輕腎臟重量；可以改善DN狀態(tài)下的脂代謝紊亂：降低血清總膽固醇、LDL水平，提高HDL水平；改善氧化還原失衡狀態(tài)：提高血清SOD水平、降低血清MDA水平，降低血清AGEs水平和紅細(xì)胞內(nèi)SB含量；改善腎臟

10、功能：減少24 h尿液體積和微白蛋白排出量，提高尿液尿素氮、Crea水平，降低血清BUN、Crea水平，提高肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)；減輕腎小球胞外基質(zhì)聚積和系膜區(qū)增寬程度，抑制腎小球TGF-β1、CTGF、VEGF、VEGF mRNA、colla IV的過度表達(dá)。除對SB的影響外，AS能夠減弱UCN對STZ-CFA誘導(dǎo)的DN模型的作用。此外，本文還研究了STZ-CFA輔以高脂飲食誘導(dǎo)的D

11、N模型腎臟UCN表達(dá)的變化。采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法分別檢測UCN mRNA和UCN在腎臟組織的表達(dá)。結(jié)果表明，UCN mRNA在DN模型大鼠腎表達(dá)有增加的趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而UCN在腎臟組織中的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，由于時(shí)間所限，此結(jié)果僅為初步結(jié)果，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。 綜上所述，UCN能夠改善腎臟功能，減少尿微白蛋白排出，這與UCN通過多途徑對抗DN發(fā)展的機(jī)制有關(guān)：抑制MC異常增殖，抑制促纖維化因子(TGF