人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提純及生物學(xué)活性鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　?。?）運(yùn)用貼壁法與流式細(xì)胞分選方法分離提純?nèi)怂韬碎g充質(zhì)干細(xì)胞（nucleus pulposus mesenchymal stem cells，NPMSCs）。
　?。?）從細(xì)胞形態(tài)、增殖特點(diǎn)、免疫免疫表型、三系分化等方面比較兩種方法獲得的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)活性。
　　方法：
　　收集腰椎間盤(pán)突出癥患者的退變髓核組織（Pfirrmann分級(jí)均為Ⅳ級(jí)），利用酶消化法分離細(xì)胞。分別采用兩種方法分離提純

2、NPMSCs，一組細(xì)胞采用貼壁法培養(yǎng)，另一組通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)利用NPMSCs表面陽(yáng)性標(biāo)志物CD73、CD90、CD105獲得NPMSCs。將兩種方法獲得的NPMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，CCK-8檢測(cè)增殖能力。向成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)28天后分別進(jìn)行茜素紅染色觀察其成骨能力、油紅O染色觀察其成脂能力、甲苯胺藍(lán)染色觀察其成軟骨能力，利用Imag J軟件計(jì)算染色區(qū)域所占的面積百分比。比較兩組NPMSCs在形態(tài)

3、學(xué)，免疫表型以及增殖和分化能力的差異。
　　結(jié)果：
　?。?）流式細(xì)胞分選儀以PE-CD73、APC-CD90、V450-CD105作為表面陽(yáng)性標(biāo)志，分選出 CD73+、CD90+、CD105+三陽(yáng)性的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，平均獲得數(shù)為(3.53±0.78)×106個(gè)，其比例約（89.67±2.52）％。貼壁法獲得的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞CD73、CD90、CD105的陽(yáng)性表達(dá)率，分別為（89.79±2.40）%，（94.07±2.3

4、1）%，（90.49±1.63）%。
　　（2）經(jīng)酶消化后的原代細(xì)胞在接種后5-7h貼壁，原代細(xì)胞呈長(zhǎng)短不一的短梭形，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80-90%融合時(shí)，可見(jiàn)旋渦狀生長(zhǎng)或者以組織塊為中心的漩渦形成，排列整齊。流式細(xì)胞分選方法獲得的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞在接種后4-6h觀察到貼壁生長(zhǎng)，主要以旋渦狀生長(zhǎng)為主，少見(jiàn)散在的單個(gè)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，12-15天細(xì)胞可達(dá)到80-90%融合。
　　（3）在培養(yǎng)4h-1d，流式組NPMSCs的增殖活力明顯低

5、于貼壁組NPMSCs（P<0.05），第3天兩組 OD值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在第5d-13d，流式組 NPMSCs增殖能力明顯高于貼壁組NPMSCs（P<0.05）。
　?。?）流式組NPMSCs流式細(xì)胞儀免疫表型的檢測(cè)結(jié)果顯示，CD73的表達(dá)率為(98.55±0.35)%，CD90的表達(dá)率為(98.47±0.57)%，CD105的表達(dá)率為(98.20±1.24)%，表達(dá)率明顯高于貼壁組NPMSCs。流式組NPMSC

6、s造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45、CD34及HLA-DR等的表達(dá)率均低于4%。
　?。?）成骨誘導(dǎo)分化：兩組NPMSCs經(jīng)誘導(dǎo)28天后，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有黑色不透光區(qū)域，經(jīng)茜素紅染色后可見(jiàn)細(xì)胞表面存在大量紅染的鈣鹽沉積，肉眼觀可見(jiàn)流式組NPMSCs紅染面積多于貼壁組NPMSCs，應(yīng)用Imag J軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)得流式組NPMSCs紅染面積的比例明顯高于貼壁組NPMSCs（P<0.05）。成脂誘導(dǎo)分化：兩組NPMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)28

7、天后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有大小不等的光亮圓形脂滴形成，經(jīng)油紅“O”染色均可見(jiàn)片狀或點(diǎn)狀的紅染脂滴空泡，應(yīng)用Imag J軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)得流式組NPMSCs紅染面積的比例明顯高于貼壁組NPMSCs（P<0.05）。成軟骨誘導(dǎo)分化：兩組NPMSCs經(jīng)誘導(dǎo)28天后，均可見(jiàn)乳白色的軟骨微球形成，甲苯胺藍(lán)染色后兩種細(xì)胞均可見(jiàn)明顯藍(lán)染的軟骨細(xì)胞，Imag J軟件分析發(fā)現(xiàn)流式組NPMSCs藍(lán)染軟骨細(xì)胞面積明顯高于貼壁組NPMSCs（P<0.0