枸杞多糖對(duì)大鼠脊髓夾傷作用的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)的修復(fù),是神經(jīng)科學(xué)臨床研究與基礎(chǔ)研究的重要課題。我們已在臨床上開(kāi)展損傷早期(傷后4~14 d)髓內(nèi)清創(chuàng)減壓術(shù)的研究,獲得了滿(mǎn)意的效果;回到相關(guān)的基礎(chǔ)研究,為促進(jìn)進(jìn)一步功能恢復(fù)和組織保護(hù),藥物干預(yù)SCI后繼發(fā)損傷機(jī)制的研究就尤為重要。其中,藥物干預(yù)炎癥機(jī)制,尤其是針對(duì)炎癥反應(yīng)的雙刃劍式作用(加重?fù)p傷/促進(jìn)修復(fù)),如巨噬細(xì)胞的M1/M2極化,是我們的重點(diǎn)方向。枸杞多糖(Lycium B

2、arbarum Polysaccharide,LBP),為傳統(tǒng)中藥枸杞的水溶性提取物,其已知的功能,除直接的神經(jīng)保護(hù)和抗氧化作用,還可調(diào)節(jié)免疫功能,而神經(jīng)損傷、氧化應(yīng)激和免疫機(jī)制均為SCI中導(dǎo)致繼發(fā)損傷的重要機(jī)制。但目前針對(duì)LBP在脊髓損傷中的作用尚無(wú)直接證據(jù)。
　　脊髓損傷研究面臨的另外一個(gè)重要問(wèn)題在于病理變化復(fù)雜且細(xì)微,因此,建立重復(fù)性和穩(wěn)定性好的動(dòng)物模型至關(guān)重要。目前,大鼠脊髓損傷模型中以撞擊傷和擠壓傷模型最為常用。雖然兩者

3、都可很好地模擬臨床脊髓損傷的病理過(guò)程,但它們都存在自損傷部位起,沿脊髓長(zhǎng)軸向髓內(nèi)遠(yuǎn)端分布的出血,該成分隨病程進(jìn)行性變化,且范圍和程度難以控制,是建立穩(wěn)定模型所必須解決的問(wèn)題。
　　對(duì)于上述髓內(nèi)損傷遠(yuǎn)端出血的成因,目前尚無(wú)合理統(tǒng)一的解釋。因此本研究的第一部分在大鼠脊髓擠壓損傷模型對(duì)此進(jìn)行了探討。
　　針對(duì)脊髓撞擊傷和擠壓傷模型存在的問(wèn)題,本研究的第二部分根據(jù)前一部分結(jié)果,針對(duì)一種脊髓夾傷模型進(jìn)行改良,最大限度降低遠(yuǎn)端出血的干擾

4、,獲得病理過(guò)程相對(duì)穩(wěn)定的大鼠脊髓損傷模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　在模型研究基礎(chǔ)上,本研究的第三部分針對(duì)LBP在大鼠脊髓損傷的治療作用展開(kāi)研究,尤其關(guān)注了LBP對(duì)SCI后的免疫調(diào)節(jié)和組織保護(hù)的作用機(jī)制。
　　第一部分:脊髓擠壓損傷中髓內(nèi)遠(yuǎn)端出血的成因。
　　脊髓擠壓損傷模型是以重物緩慢壓迫脊髓,造脊髓腹背向完全受壓。
　　經(jīng)組織學(xué)觀(guān)察:傷后6 h和3 d,在脊髓損傷位置以遠(yuǎn)可見(jiàn)明顯出血,其具體位于后索內(nèi)皮質(zhì)脊

5、髓束與其背側(cè)白質(zhì)之間。
　　我們于損傷即刻,在損傷區(qū)域吻尾端切斷脊髓后索,結(jié)果表明,至傷后3 d,遠(yuǎn)端出血未出現(xiàn);于損傷即刻在損傷中心注射碳粉,結(jié)果示,在傷后6 h遠(yuǎn)端出血內(nèi)可見(jiàn)碳粉存在。
　　該結(jié)果提示,遠(yuǎn)端出血來(lái)源于損傷中心出血的直接擴(kuò)散,而不是形成于遠(yuǎn)處血管結(jié)構(gòu)的直接受損;其分布特征的形成,可能與后索內(nèi)皮質(zhì)脊髓束及其背側(cè)白質(zhì)有關(guān)。所以,避免該遠(yuǎn)擴(kuò)出血關(guān)鍵可能在于控制損傷區(qū)的出血程度。
　　第二部分:在夾傷模型避免

6、遠(yuǎn)擴(kuò)出血,獲得一種穩(wěn)定的大鼠脊髓損傷模型。
　　鑒于第一部分的結(jié)果,為避免遠(yuǎn)擴(kuò)出血,我們采用鑷子從兩側(cè)夾傷脊髓造模,選擇該模型是因?yàn)?1)便于調(diào)整擠壓程度,即通過(guò)設(shè)置最終脊髓夾傷狀態(tài)時(shí)鑷子兩刃保留的間距來(lái)調(diào)節(jié)夾傷程度;2)擠壓力從兩側(cè)向內(nèi)作用到脊髓,減輕牽扯后索內(nèi)的皮質(zhì)脊髓束。
　　我們?cè)觳煌潭鹊募顾鑺A傷,即設(shè)置鑷子在脊髓夾傷狀態(tài)下最終保留的間距分別為0.2,0.5或0.8 mm,比較損傷即刻出血范圍:在0.5 mm的損傷

7、,損傷中心主要為一梭形出血灶,無(wú)遠(yuǎn)擴(kuò)出血,損傷結(jié)果穩(wěn)定,個(gè)體差異小(變異率10.4％);其他損傷程度,過(guò)重(鑷子間距0.2 mm)可致遠(yuǎn)擴(kuò)出血,過(guò)輕(鑷子間距0.8 mm)可間接增強(qiáng)系統(tǒng)誤差的影響,個(gè)體間差異均較大(變異率:0.2 mm,22%;0.8 mm,55%)。
　　在上述0.5 mm的夾傷中,出血主要分布脊髓灰質(zhì)內(nèi),所以?xún)蓚?cè)灰質(zhì)內(nèi)出血占總出血絕大部,中央管附近灰質(zhì)內(nèi)出血占小部。我們?cè)诓煌笭钋忻娣謩e統(tǒng)計(jì)出血范圍并統(tǒng)計(jì)動(dòng)物

8、間個(gè)體差異,其中,在包含了一側(cè)灰質(zhì)主要部分的切面內(nèi)的出血范圍,其個(gè)體差異(變異率8%)明顯低于中央管附近切面(變異率17%)。
　　在傷后7 d,0.5 mm損傷仍造成穩(wěn)定的繼發(fā)損傷,包括損傷范圍(變異率9.9%)、損傷旁區(qū)殘留神經(jīng)元數(shù)量(變異率10.2%)、少突細(xì)胞凋亡數(shù)量(變異率13.5%)、巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞活化(變異率11%)。
　　所以,0.5 mm的夾傷可避免遠(yuǎn)擴(kuò)出血,所致原發(fā)損傷個(gè)體差異小,為一種穩(wěn)定的脊髓損傷模

9、型。其中,兩側(cè)灰質(zhì)內(nèi)的損傷結(jié)果尤為穩(wěn)定,可作為良好的觀(guān)察對(duì)象。
　　第三部分:LBP對(duì)大鼠脊髓夾傷的作用
　　方法:
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在上述大鼠脊髓夾傷模型開(kāi)展(鑷子間距0.5 mm)。
　　LBP給藥方案有兩種,分別針對(duì)各自目的:LBP-pre,因LBP起效慢,且已有LBP的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都在疾病模型建立前數(shù)天即開(kāi)始給藥,所以,為保證損傷即刻LBP即開(kāi)始起效和便于與以往的LBP研究結(jié)果比較,我們從損傷前第7 d開(kāi)始給藥,

10、至處死動(dòng)物取材;LBP-aft,在脊髓損傷后7 d開(kāi)始給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,該部實(shí)驗(yàn)視LBP為SCI后的一項(xiàng)治療性干預(yù)進(jìn)行研究。對(duì)照組分別在同時(shí)刻給雙蒸水,所有藥物經(jīng)胃給予。
　　在LBP-pre組的傷后7 d和14 d以及LBP-aft組的傷后14 d,Western Blotting(WB)檢測(cè)ED1,iNOS(M1型極化巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志)和Arg1(M2型極化巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志);形態(tài)學(xué)檢測(cè)包括:損傷區(qū)面積(以GFAP強(qiáng)陽(yáng)性

11、標(biāo)記為邊緣),在損傷旁區(qū)(GFAP邊緣以外一定范圍內(nèi))比較GFAP和ED1(人CD68的大鼠同型物,活化巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志)免疫熒光強(qiáng)度,并計(jì)數(shù)ED1+iNOS+(M1型極化巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞)和ED1+Arg1+(M2型極化巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞)細(xì)胞;
　　細(xì)胞培養(yǎng)是為進(jìn)一步驗(yàn)證在體實(shí)驗(yàn)中關(guān)于膠質(zhì)瘢痕和巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)果,包括大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和N9小膠質(zhì)細(xì)胞系的培養(yǎng)。
　　原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,給予處理:LBP v.s.空

12、白對(duì)照;LBP聯(lián)合TNFα+IFNγ+LPS v.s. TNFα+IFNγ+LPS。在免疫細(xì)胞染色檢測(cè)熒光強(qiáng)度,結(jié)合WB,比較GFAP表達(dá)差異。其中,已知TNFα+IFNγ+LPS可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。
　　N9細(xì)胞大體包括2部分實(shí)驗(yàn):
　　1)為明確LBP以及LBP聯(lián)合LPS+IFNγ(刺激巨噬細(xì)胞M1極化)或IL-4(刺激巨噬細(xì)胞M2極化)對(duì)N9細(xì)胞極化的影響,分別一次性給予以下處理:LBP v.s.空白對(duì)照;LBP聯(lián)

13、合LPS+IFNγv.s. LPS+IFNγ;LBP聯(lián)合IL-4 v.s. IL-4。
　　2)為在N9細(xì)胞模擬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中LBP-pre和LBP-aft,接連給予N9細(xì)胞兩種不同的刺激,每種刺激持續(xù)1 d?！癓BP-pre”:1st d,LBP,2nd d,LBP聯(lián)合LPS+IFNγ+IL-4;對(duì)照組每天給予無(wú)LBP的相同刺激?！癓BP-aft”:1st d,LPS+IFNγ+IL-4,2nd d,LBP聯(lián)合LPS+IFNγ+IL

14、-4;對(duì)照組每天給予無(wú)LBP的相同刺激。WB檢測(cè)iNOS和Arg1水平。
　　結(jié)果:
　　損傷區(qū)范圍的結(jié)果出乎我們意料:LBP-pre組在7 d和14 d均較其對(duì)照組損傷面積擴(kuò)大(7 d:1.30 v.s.0.97,14 d:1.17 v.s.0.75 mm2);LBP-aft則相反,傷后14 d損傷面積較對(duì)照縮小(0.56 v.s.0.80 mm2)。
　　為解釋上述LBP對(duì)損傷組織損傷的相反影響,開(kāi)展以下實(shí)驗(yàn):

15、r>　　星形膠質(zhì)細(xì)胞為膠質(zhì)瘢痕主要成分,直接影響損傷區(qū)變化,原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和在體結(jié)果示,各種給藥方式下的LBP對(duì)GFAP表達(dá)均沒(méi)有影響。
　　ED1是巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志之一。LBP-pre較對(duì)照組,在7 d和14 d,ED1熒光強(qiáng)度均增加,且該熒光強(qiáng)度增加與損傷范圍擴(kuò)大成正相關(guān),WB亦示,LBP-pre動(dòng)物ED1表達(dá)水平在7 d和14 d均高于對(duì)照組;但LBP-aft動(dòng)物較對(duì)照組,在傷后14 d的ED1熒光強(qiáng)度和WB均未

16、見(jiàn)差別。
　　ED1結(jié)果仍不能完全解釋損傷范圍的變化,于是我們轉(zhuǎn)向巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的M1/M2極化(iNOS/Arg1)。
　　iNOS和Arg1:
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn),WB結(jié)果示:LBP-pre較對(duì)照組,在7 d和14 d,均上調(diào)iNOS,下調(diào)Arg1, iNOS/Arg1比值增加;LBP-aft較對(duì)照組,在14 d,iNOS和 Arg1均增加,但后者增加的幅度更大,所以iNOS/Arg1比值減小。因iNOS也可表達(dá)于中性

17、粒細(xì)胞、神經(jīng)元等,我們行免疫熒光染色以明確iNOS/Arg1比值是否反應(yīng)M1/M2變化:損傷旁區(qū)內(nèi)iNOS和Arg1主要表達(dá)在ED1+細(xì)胞,LBP-pre的給藥組較對(duì)照ED1表達(dá)上調(diào),M1細(xì)胞增多, M2細(xì)胞減少,M1/M2比例上調(diào)。LBP-aft的治療組較對(duì)照M1無(wú)明顯差異,M2細(xì)胞增多,M1/M2比例下降。
　　在N9,LBP或LBP聯(lián)合IL-4均較各自對(duì)照組,iNOS水平提高,Arg1下降,雖然LBP聯(lián)合LPS+IFNγ與其

18、對(duì)照間未見(jiàn)差別。在模擬在體LBP-pre和LBP-aft給藥方案的N9細(xì)胞實(shí)驗(yàn),“LBP-pre”較對(duì)照組,仍為iNOS上調(diào),Arg1下調(diào);但“LBP-aft”較對(duì)照組,反而iNOS下降,Arg1增加。
　　綜上,LBP-pre和LBP-aft分別加重組織受損和促進(jìn)組織修復(fù)。鑒于SCI中M1極化加重組織受損,M2極化促進(jìn)組織修復(fù),M1/M2比值則決定巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的“好壞”,所以?xún)煞N給藥方式下LBP對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響差別可能解