IL-1ra對大鼠肝星狀細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原及TIMP-1mRNA表達影響的研究.pdf

1、目的：用改良方法分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠肝星狀細胞(Hepaticstellatecells，HSCs)，觀察白細胞介素-1受體拮抗劑(interleukinⅠreceptorantagonistIL-1ra)對HSCsⅠ型膠原(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ，Col-Ⅲ)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitorofmetalloproteinase1，TIMP-1)基因表達的影響，初步

2、探討IL-1ra對HSCs產(chǎn)生Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及TIMP-1mRNA作用的可能機制，為臨床治療和/或預防肝纖維化提供實驗性理論依據(jù)。 方法：取體重為480g的Wistar大鼠1只，禁食禁水12小時，以2％戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定于手術臺上。常規(guī)消毒，以十字切口切開腹腔，翻出腸管，充分暴露門靜脈，用留置針頭穿刺門靜脈，固定，退出針芯，接通灌注系統(tǒng)。先用預灌注液(已預溫至37℃)進行灌注。然后迅速剪斷后腔靜脈，以每分鐘10ml

3、的速率緩慢灌注約十分鐘，當整個肝臟變成黃色時，換用已預熱至37℃含Ⅳ型膠原酶(CollagenaseTypeⅣ)溶液灌注，至整個肝臟幾乎呈液狀。此時，小心將肝臟從大鼠腹腔中切除，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入超凈工作臺進行操作。首先將肝臟組織撕碎，去除肝包膜及結締組織，剪碎肝組織，倒入一預先裝有50ml振蕩消化液三角燒瓶，再加入含0.6g/LCaCl2的D-Hanks液至100ml。將三角燒瓶放入恒溫振蕩器，振蕩消化30分鐘(200r/mi

4、n，37℃)，所得細胞懸液依次經(jīng)150目、200目金屬網(wǎng)過濾，將濾液平均收集于兩個容量為50ml的離心管中。500×g離心7分鐘，棄上清。每管加入40ml1640培養(yǎng)液，反復吹打，使細胞充分混勻。50×g離心2分鐘(20℃)，反復兩次，棄沉淀。上清液500×g離心7分鐘(20℃)，棄上清，沉淀用1640培養(yǎng)液500×g離心沖洗兩次。將兩管細胞沉淀合并，分別加入1640液12ml、330g/LNycodenz液6ml，充分混勻，將細胞懸液

5、分裝入兩個10ml的離心管。在細胞懸液上小心滴加一層1640培養(yǎng)液，1500×g離心15分鐘(20℃)。將1640液與細胞懸液交界面間的細胞吸出，用1640液500×g離心7分鐘(20℃)，沖洗兩次。然后將細胞懸浮于含20％(體積分數(shù))胎牛血清1640培養(yǎng)基中，移至細胞培養(yǎng)瓶，放入37℃、5％CO2(體積分數(shù))培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。用熒光顯微鏡觀察新鮮分離的HSCs，HSCs在波長為328nm熒光顯微鏡下能自發(fā)的發(fā)出藍綠色熒光。用Desmi

6、n免疫細胞化學染色法鑒定所分離的HSCs。將分離的HSCs以1×109/L濃度接種于150ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時后換液，2～3天傳代一次。用0.25％胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成單個細胞懸液，以每孔103個細胞接種孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24小時。然后加入不同濃度的IL-1ra，3孔重復。另外，以只含1640培養(yǎng)液

7、孔作為空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔按培養(yǎng)液量的10％既20μl加入MTT(濃度為5mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞楓(DimethylsulfoxideDMSO)。然后在振蕩器上振蕩10分鐘，使吸附在細胞上的藍色結晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定光吸收值，測定波長為490nm，以只加1640培養(yǎng)液的孔為空白對照組，記錄結果。細胞存活率=實驗組吸收值/對照組吸收值×100％。選擇

8、HSCs細胞存活率在90％以上IL-1ra的濃度作為試驗所需的濃度。取處于對數(shù)生長期的HSC，以1×105的密度接種于含10％胎牛血清的200ml培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2(體積分數(shù))培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入預先配制好的IL-1ra溶液，使其達到實驗所需的濃度。低濃度組：加入配制好的IL-1ra溶液，使其最終濃度為1ng/ml；中濃度組：加入配制好的IL-1ra溶液，使其最終濃度為10ng/ml；高濃度組：加入配制好的IL-1ra溶液

9、，使其最終濃度為100ng/ml。用濃度分別為1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml三個濃度梯度分別作用于大鼠的HSCs48小時，提取總mRNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄，用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RealTime-PCR)方法檢測Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA的表達。在體外觀察IL-1ra對HSCs中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA表達的影響。 結果：對照組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA

10、的表達水平分別為1.97±0.29、2.70±0.57、3.83±0.30。而分別加入1ng/ml、10ng/ml、100ng/mlIL-1ra后Col-Ⅰ基因表達水平依次為1.34±0.35、0.86±0.19、0.35±0.03；Col-Ⅲ基因表達水平依次為2.02±0.29、1.13±0.09、0.47±0.11；TIMP-1mRNA的表達水平依次為3.12±0.25、2.53±0.38、1.98±0.18，與對照組比較，不同濃度