生物節(jié)律相關(guān)基因BMAL1和CRY1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制探討.pdf

1、從正常人全腦marathoncDNA中克隆到人生物節(jié)律基因BMALl和CRYl的開放讀碼框架(ORF)，經(jīng)酶切和測序鑒定與GeneBank數(shù)據(jù)庫中收錄的序列基本一致。其中BMALl定位于染色體1lpl5，含有20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子；編碼蛋白626aa,分子量為68kDa；蛋白序列與已知的ARNT和AHR高度同源，為含有bHLH-PAS結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；在果蠅、爪蟾、小鼠、大鼠和人等生物中均有同源物表達(dá)。CRYl定位于12q23—2

2、4．1，含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子；編碼蛋白586aa,分子量66kDa；蛋白序列與果蠅photolyase同源，兩種CRY蛋白結(jié)構(gòu)上同源性高，都含有DNAphotolyase和FADDNAbinding結(jié)構(gòu)域；從果蠅到小鼠和人都可以發(fā)現(xiàn)CRYl的同源物表達(dá)。 通過Northern雜交MTN多組織膜片顯示，BMALl有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別為2．0kb、2．8kb和5．0kb,其在心、胎盤、肝、骨胳肌和腎中都有較高水平的表達(dá)；CRY

3、l有1個(gè)約3．0kb的轉(zhuǎn)錄本，在各種正常人組織中都有表達(dá)。RT-PCR也可以從正常肝組織、胎盤、卵和腦中擴(kuò)增出BMALl與CRYl基因片段。說明BMALl與CRYl可以在各種人正常組織中表達(dá)。通過RT-PCR在4種肝癌細(xì)胞，2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，2種肺癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，卵巢癌細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞，骨肉廟細(xì)胞等13種腫瘤細(xì)胞中檢測到BMALl和CRYl的表達(dá)。說明這兩種生物節(jié)律基因不僅在各種人正常組織中表達(dá)，同樣在離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中也可以表達(dá)

4、。 為了檢測BMALl與CRYl在肝癌與癌旁組織中的表達(dá)差異，分別使用了Northernblot、半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法分析。Northernblot結(jié)果顯示，在8對肝癌與癌旁組織中,BMALl和CRYl均在87．5％(7／8)癌旁組織中有相對高的表達(dá)；反轉(zhuǎn)錄PCR檢測另外8對肝癌與癌旁組織結(jié)果為，BMALl和CRYl在62．5％(5／8)的癌旁組織中有相對高的表達(dá)；免疫組化分析163對肝癌與癌旁組織中BMALl的

5、表達(dá)在癌旁組織(53％)高于肝癌(23％)，而CRYl在185對樣品中也于癌旁組織(29％)高于肝癌中(12％)。以上試驗(yàn)說明，BMALl和CRY1-基因在肝癌及對應(yīng)的癌旁組織中都有表達(dá)，而且在同樣的樣品中呈現(xiàn)癌旁表達(dá)高于肝癌組織的趨勢。 GFP亞細(xì)胞定位確定二者均定位于細(xì)胞核中，與以前在其它生物中細(xì)胞定位的結(jié)果一致，說明二者的生物作用主要發(fā)生在核內(nèi)。將BMALl與CRYl均亞克隆到真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，通