采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌細(xì)胞的甲基化基因.pdf

1、鼻咽癌(NPC)是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制還不清楚。DNA甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，DNA甲基化修飾導(dǎo)致抑瘤基因等的沉默在癌變過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。因此，篩選鼻咽癌的甲基化失活基因?qū)⒂兄诮沂颈茄拾┑陌l(fā)病機(jī)制，具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。 本研究以高轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞系5-8F為對(duì)象，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌細(xì)胞的甲基化失活基因。首先用MTT比色法和流式細(xì)胞儀分析確定去甲基化藥物5-雜氮

2、-2’-脫氧胞苷(5-aza-2-dC)處理5-8F細(xì)胞的最適濃度。然后應(yīng)用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分離5-aza-2-dC處理與未處理5-8F細(xì)胞的蛋白質(zhì)；利用PDQuest圖像分析軟件比較兩者2-DE圖譜的異同，識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)；采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)差異蛋白質(zhì)nm23-H1的表達(dá)水平；再采用甲基化特異性PCR(M

3、SP)檢測(cè)5-8F細(xì)胞中nm23-H1基因的甲基化。主要結(jié)果如下： 1.采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立了5-aza-2-dC處理與未處理鼻咽癌細(xì)胞株5-8F細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，識(shí)別了49個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，鑒定了33個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中包括nm23-H1在內(nèi)的15個(gè)蛋白質(zhì)在5-aza-2-dC處理后表達(dá)上調(diào)，而18個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。15個(gè)5-aza-2-dC處理后表達(dá)上調(diào)的基因可能是5.8F細(xì)胞中的甲基化沉默基因。

4、2.Western blot結(jié)果顯示：在5-aza-2-dC處理5-8F細(xì)胞后，nm23-H1蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，這與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果一致。 3.MSP結(jié)果顯示，5-aza-2-dC處理5-8F細(xì)胞后，nm23-H1基因啟動(dòng)子甲基化水平降低，而非甲基化水平增加。RT-PCR結(jié)果顯示，5-aza-2-dC處理后，nm23-H1基因mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)果說(shuō)明，nm23-H1基因是5-8F細(xì)胞中的甲基化沉默基因。 本研