ALL細(xì)胞的ROS水平對DNR細(xì)胞毒作用的影響.pdf

1、目的和意義： 個體化治療的發(fā)展使兒童急性白血病（Acute leukemia, AL）的療效大大提高。藥物代謝和腫瘤細(xì)胞的關(guān)系密切。研究提示柔紅霉素（Daunorubicin，DNR）能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系凋亡，同時有活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS )水平的改變。本課題主要研究兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphocyte leukemia, ALL)個體之間的ROS水平與DNR細(xì)胞毒作用

2、的關(guān)系，為個體化治療提供一定的實驗依據(jù)。 方法： 采用淋巴細(xì)胞分離液分離出AL細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞的固有ROS、DNR（50、100、500ng/ml）、大黃素（Emodin，E）10uM/L和聯(lián)合用藥（E10uM/L +DNR50ng/ml）誘導(dǎo)24小時后的 ROS水平，每次以U937細(xì)胞的ROS值作對照；誘導(dǎo)48小時后，用四甲基偶氮唑鹽（Methyl-thiazol-te

3、trazolium，MTT）法檢測以上各組及DNR100ng/ml和N-乙酰-L-半胱氨酸(Nacetylcysteine, NAC)10mM/L 聯(lián)合用藥后的細(xì)胞相對活力；運用FCM和hoechst33342-PI染色法觀察凋亡現(xiàn)象。 結(jié)果： 1、11例兒童ALL細(xì)胞的固有ROS水平與DNR 的IC50呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。在14例兒童AL 中（其中11例ALL，3例急性髓系白血?。╝cute myeloid le

4、ukemia，AML）），細(xì)胞的固有ROS水平與DNR IC50也呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。 2、11例ALL細(xì)胞的固有ROS水平之間有差異（p<0.05）。以U937細(xì)胞的ROS值為對照，其固有ROS水平為0.2602±0.1178，11例經(jīng)50ng/ml、9例經(jīng)100ng/ml、7例經(jīng)500ng/ml的DNR誘導(dǎo)24小時后，ROS分別為0.2908±0.1315，0.2849±0.1254和0.2565±0.0987。DNR

5、50、100ng/ml時ROS上升（p<0.05），而DNR500ng/ml時與固有ROS水平無差別，但較DNR100ng/ml時有下降（p<0.05）。在15例AL細(xì)胞中（11例ALL，4例AML），經(jīng)DNR50、100ng/ml誘導(dǎo)后ROS水平也上升，至DNR500ng/ml時開始下降（p<0.05）。 3、11例ALL細(xì)胞經(jīng)DNR（50、100、500ng/ml）誘導(dǎo)48小時后細(xì)胞相對活力隨著濃度的升高而下降，分別為75.

6、45±18.02％，53.85±18.76％和41.54±21.23％（p<0.05）。14例AL細(xì)胞（11例ALL，3例AML）經(jīng)以上濃度誘導(dǎo)后，細(xì)胞活力亦逐漸下降（p<0.05）。 4、在5例AL細(xì)胞中，經(jīng)NAC10mM/L 與DNR100ng/ml聯(lián)合用藥48小時后，細(xì)胞相對活力顯著升高（p<0.05），從單用DNR100ng/ml的56.33±17.46％上升到104.63±22.19％。 5、DNR誘導(dǎo)ALL細(xì)

7、胞后，F(xiàn)CM和hoechst33342-PI染色均檢測到凋亡和壞死，并隨著濃度的增加凋亡增多。 6、以U937細(xì)胞的ROS值為對照，10例ALL細(xì)胞的固有ROS水平為0.2587±0.1294，經(jīng)DNR50ng/ml、E10uM/L 和DNR50ng/ml+E10uM/L 聯(lián)合用藥24小時后ROS分別為0.2941±0.1447，0.3159±0.1522和0.3421±0.1706，均能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平（p<0.05），且

8、聯(lián)合用藥比DNR單用具有更高的ROS水平（p<0.05）。12例AL細(xì)胞（10例ALL，2例AML）中，以上各組亦能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平（p<0.05）但聯(lián)合用藥與DNR單用的ROS水平無明顯差異（p＞0.05）。 7、11例ALL細(xì)胞經(jīng)E10uM/L 誘導(dǎo)48小時后，細(xì)胞相對活力為102.17±14.45％，無明顯的細(xì)胞毒性（P＞0.05），聯(lián)合用藥組比DNR組具有更強(qiáng)的細(xì)胞抑制率，細(xì)胞活力從75.45±18.01％下降到58

9、.22±19.16％( p<0.05)；兩藥相互作用指數(shù)（Combination index，CI）<1，具有協(xié)同作用( p<0.05)，且能達(dá)到DNR100ng/ml的抑制效果（P＞0.05）。在14例AL中（11例ALL，3例AML），得出的結(jié)果同ALL。 8、11例ALL中耐藥組（IC50> 225.77ng/ml）和敏感組（IC50<225.77ng/ml）的固有ROS水平分別為0.1811±0.0765和0.3065±

10、0.0594，兩者有顯著性差異（p<0.01）。DNR50ng/ml聯(lián)用E10uM/L 后，耐藥組細(xì)胞活力由88.82±11.68％下降到73.18±13.12％ ，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），而敏感組細(xì)胞抑制率無明顯上升（P＞0.05）。在14例AL中（11例ALL，3例AML），結(jié)果同ALL。 9、ALL細(xì)胞經(jīng)DNR合用E后，形態(tài)學(xué)上觀察到凋亡現(xiàn)象增強(qiáng)。 10、與臨床危險度分析得出：在19例ALL患兒中，高危組的固

11、有ROS水平低于低危組（P＜0.05）。固有ROS水平與性別、年齡、免疫分型、初發(fā)時外周血白細(xì)胞數(shù)、藥物影響、潑尼松反應(yīng)和第19天骨髓幼稚數(shù)無關(guān)；兒童初發(fā)ALL細(xì)胞的固有ROS水平（0.2801±0.1206）低于AML（0.4197±0.1374），有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。 結(jié)論： 1、ALL和AL細(xì)胞固有ROS水平與DNR的細(xì)胞毒性正相關(guān)。 2、ALL個體固有ROS水平之間有差異。DNR誘導(dǎo)ALL和AL