RNA干擾沉默Lingo-1基因?qū)ψ陨砻庖咝阅X脊髓炎髓鞘修復(fù)的影響.pdf

1、研究背景：
　　多發(fā)性硬化（MS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病，是青年人常見致殘的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。髓鞘再生失敗和軸突損害是MS患者遺留永久神經(jīng)功能損害的病理基礎(chǔ)，其中反復(fù)的髓鞘脫失可以導(dǎo)致軸突損傷。故盡快修復(fù)髓鞘，是防止軸突損害和減少殘疾發(fā)生的關(guān)鍵。賴氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（Leucine rich repeat and Ig domain containing1，Lingo-1）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘細胞（少突膠質(zhì)細胞）分

2、化成熟的負性調(diào)控因子。EAE是目前公認的廣泛應(yīng)用于研究的多發(fā)性硬化動物模型。
　　本研究通過RNA干擾抑制Lingo-1表達,觀察Lingo-1抑制對少突膠質(zhì)細胞和EAE的影響并探討其機制，為下一步多發(fā)性硬化Lingo-1阻斷治療做一些有益的嘗試。本研究分三部分。
　　第一部分 Lingo-1shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及篩選
　　目的：篩選出對小鼠少突膠質(zhì)細胞Lingo-1表達沉默效率較高的Lingo-1shRNA慢病

3、毒載體。
　　方法：
　　1.體外原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細胞，取材自新生48h內(nèi)小鼠大腦皮質(zhì)；應(yīng)用不同分離純化方法后測定細胞存活率和純度，摸索較為理想的細胞獲取方法；并進行Lingo-1、MBP免疫熒光鑒定。
　　2.將編碼Lingo-1shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞后，對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細胞行MTT細胞增殖實驗，觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)對細胞生存的影響。
　　3.轉(zhuǎn)導(dǎo)后96h應(yīng)用RT-qPCR方法檢測了Lingo-1mRNA水平的變化

4、；應(yīng)用Western blot方法檢測Lingo-1蛋白質(zhì)水平的變化；應(yīng)用免疫細胞熒光，觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)后少突膠質(zhì)細胞上Lingo-1的表達并計數(shù)細胞Lingo-1陽性率；篩選出抑制效果最佳的Lingo-1shRNA慢病毒載體。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)的小鼠少突膠質(zhì)細胞經(jīng)輕度胰酶消化+短時間振蕩法和振蕩分離法兩種不同分離純化方法細胞純度相近（P>0.05），但輕度胰酶消化+短時間振蕩法細胞存活率更高（96.46+2.26％vs

5、80.25+1.55％，P<0.05）。培養(yǎng)細胞經(jīng)Lingo-1、MBP免疫細胞熒光染色鑒定為陽性。
　　2.MTT實驗顯示Lingo-1shRNA慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞后，干擾組與正常組少突膠質(zhì)細胞OD值間沒有顯著差異（P>0.05）。
　　3.少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Lingo-1shRNA慢病毒96h后，LV/Lingo-1shRNA(1)組和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1mRNA的沉默效率分別為36％和

6、37％，明顯高于其它組（P〈0.05，P〈0.05）；LV/Lingo-1shRNA(1)組和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1蛋白的沉默效率分別為27.6％和28.3％，明顯高于其它組（P〈0.05，P〈0.05）；免疫細胞熒光染色也顯示LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)組Lingo-1蛋白含量明顯減少。
　　結(jié)論：
　　LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/

7、Lingo-1shRNA(2)為較高沉默效率的慢病毒載體，且對細胞生存率無明顯影響。LV/Lingo-1shRNA(2)用于后續(xù)的RNA干擾研究。
　　第二部分 Lingo-1shRNA慢病毒載體對少突膠質(zhì)細胞的影響
　　目的：探討Lingo-1shRNA慢病毒載體對小鼠少突膠質(zhì)細胞的影響。
　　方法：
　　1.應(yīng)用抑制效果最佳的LV/Lingo-1shRNA（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)少突膠質(zhì)細胞，應(yīng)用RT-qPCR、Weste

8、rn blot方法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1、3、7、14天Lingo-1mRNA和蛋白的表達，并和空白對照組、陰性對照組比較，觀察LV/Lingo-1shRNA（2）在不同時間的沉默效率。
　　2.應(yīng)用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1、3、5、7天少突膠質(zhì)細胞MBP蛋白表達；應(yīng)用細胞免疫熒光，計數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)后不同時間少突膠質(zhì)細胞MBP陽性率，了解Lingo-1shRNA慢病毒載體對少突膠質(zhì)細胞分化成熟過程的影響。
　　3.應(yīng)用We

9、stern blot方法檢測p-RhoA蛋白質(zhì)水平的變化，探討Lingo-1shRNA的可能作用通路。
　　結(jié)果：
　　1.少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)LV/Lingo-1shRNA(2)后第3、7、14天，干擾組的Lingo-1mRNA的沉默效率為13.2％、45.1％和57.0％，顯著高于對照組（P〈0.05,P〈0.05, P〈0.05）；第3、7、14天，干擾組的Lingo-1蛋白的沉默效率為27％、47％和53％，顯著高于對照

10、組（P〈0.05，P〈0.01，P〈0.01）。
　　2.LV/Lingo-1shRNA(2)干擾后第1天、第7天少突膠質(zhì)細胞MBP蛋白與對照組相比無顯著差異，第3天和第5天MBP蛋白的表達顯著增加（2.29±0.13vs1.23±0.08）（2.64±0.21vs1.31±0.11）（P〈0.01，P〈0.01）。LV/Lingo-1shRNA(2)干擾后第1天干擾組MBP陽性率為（45.4±5.5）％，與空白對照組無明顯差異（

11、P＞0.05）。第3、5天干擾組MBP陽性率分別為（89.7±7.9）％和（99.6±4.6）％，明顯高于對照組（P〈0.01， P〈0.05）。
　　3.LV/ Lingo-1shRNA(2)干擾后24h、48 h、72h、96h，干擾組和空白對照組之間p-RhoA蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：LV/Lingo-1shRNA對少突膠質(zhì)細胞中Lingo-1的沉默效率在一定時間內(nèi)呈逐漸增強趨勢。沉默L

12、ingo-1促體外培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞更早更快成熟。
　　第三部分 沉默Lingo-1基因表達對自身免疫性腦脊髓炎的影響
　　目的：探討沉默LINGO-1表達對EAE小鼠運動功能和髓鞘恢復(fù)的影響。
　　方法：
　　1.建立EAE小鼠模型，通過RT-PCR﹑Western-Blot方法，檢測了造模成功后第1、3、7、14、21、30天腦組織內(nèi)Lingo-1的變化，并和正常小鼠比較。
　　2.造模成功評分在2~3

13、分之間的EAE小鼠，隨機分為5組：側(cè)腦室注入5ul滴度為5×109Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA（2)組，側(cè)腦室注入5ul滴度為5×108Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA（2）組，側(cè)腦室注入5ul滴度為5×107 Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA（2）組，側(cè)腦室注入5ulLVCON053組和未治療組；通過RT-PCR﹑Western-Blot方法，檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后不同時間各組腦組織內(nèi)Lingo-1的變化。

14、
　　3.對不同組的EAE小鼠進行運動功能評分及髓鞘快藍染色，探討側(cè)腦室注入Lingo-1shRNA慢病毒載體對EAE小鼠運動功能恢復(fù)及髓鞘形成的作用。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠多在誘導(dǎo)后7-10天左右發(fā)病，總發(fā)病率為81.3％，平均臨床評分為2.45±0.94分。EAE模型組小鼠造模成功第1、3、7、14、21天LINGO-1mRNA和蛋白表達較對照組和佐劑組有明顯上調(diào)，LINGO-1蛋白表達在第7天上調(diào)最為明顯（P

15、＜0．01），其后逐漸下降，至第30天時仍略高于對照組。EAE小鼠LINGO-1mRNA的峰值則出現(xiàn)在第1天，第30天其值接近對照組（P＞0．05）。
　　2.在LV/Lingo-1-shRNA注入后第3天開始，5×107、5×108和5×109 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組Lingo-1mRNA表達明顯降低(2.45±0.15,2.06±0.18，2.14±0.08 vs2.80±0.10,P<0.05)；在第1

16、4天5×108和5×109 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組Lingo-1mRNA已降至接近于正常水平(1.19±0.11,1.46±0.10vs1.03±0.09, P＞0.05,P<0.05)。5×107 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組在第30天Lingo-1mRNA表達也接近于正常值(1.25±0.06vs1.03±0.12，P＞0.05）。在Lingo-1蛋白表達方面，5×107、5×108和5×109

17、 LV/Lingo-1-shRNA組EAE小鼠從第7天開始均有明顯下調(diào)（2.53±0.10，1.99±0.13，2.08±0，10vs3.14±0.06，P<0.05，P<0.01，P<0.01），第21天5×108和5×109 LV/Lingo-1-shRNA組 Lingo-1蛋白已降至接近正常水平（1.14±0.10，1.15±0.03vs1.01±0.03, P＞0.05, P＞0.05）。
　　3.側(cè)腦室注射LV/Ling

18、o-1shRNA（2）后，相比較于LVCON053組和未治療組，5×107 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA、5×108 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA和5×109 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA三組從第7天開始運動功能評分有不同程度的下降(3.11±0.13，2.42±0.13，2.96±0.10vs3.56±0.15,3.87±0.12,P<0.01,P<0.01, P<0.05)。其中，5×108

19、 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組運動功能改善最明顯。
　　4.側(cè)腦室注射LV/Lingo-1shRNA（2）后第30天，5×107 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組和5×108 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組髓鞘密度明顯高于未治療組（P<0.05，P<0.01），其中5×108 TU/mlLV/Lingo-1-shRNA組髓鞘修復(fù)最佳，但仍未達正常水平（P<0.05）。結(jié)論：側(cè)腦室注射LV/