應(yīng)用RhoA shRNA對(duì)原發(fā)性肝癌生物學(xué)行為的調(diào)控研究.pdf

1、研究背景與目的:原發(fā)性肝癌(PHC)是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，其死亡率位居各類惡性腫瘤的第二位。造成PHC高死亡率的主要原因是其惡性增殖的特性和易于發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是其核心環(huán)節(jié)，侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌細(xì)胞的本質(zhì)特征。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移首先來(lái)源于癌細(xì)胞個(gè)體的移行，涉及到癌細(xì)胞的變形、粘附、細(xì)胞外基質(zhì)降解、多基因激活、轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)等復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的移行過(guò)程與細(xì)胞骨架的變化密切相關(guān)。近年來(lái)人們發(fā)

2、現(xiàn)一類新的細(xì)胞因子Rho在調(diào)控細(xì)胞骨架變化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，RhoA因子是Rho家族中的標(biāo)志性因子，它在人類的很多惡性腫瘤中異常表達(dá)，提示其在腫瘤形成中發(fā)揮著重要的作用。本課題擬從肝癌生物學(xué)特性出發(fā)，探討RhoA在組織和細(xì)胞水平對(duì)PHC增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)行為的內(nèi)在分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:收集同濟(jì)醫(yī)院外科30例PHC手術(shù)切除標(biāo)本，用RT—PCR和western—Blot的方法檢測(cè)癌組織

3、、癌旁組織中RhoA基因mRNA和蛋白表達(dá)的相對(duì)水平，并通過(guò)與病例臨床病理特征(性別、腫瘤直徑、細(xì)胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無(wú)淋巴結(jié)靜脈浸潤(rùn)以及有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶)的分析，以探討RhoA基因在PHC組織增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。在體外水平，首先用RT-PCR和Western-Blot方法比較RhoA基因在各肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC7721、HepG2.2.15和Hep3B)及正常胚胎肝細(xì)胞系LO2中的表達(dá)；然后用Pgenesil-2質(zhì)

4、粒構(gòu)建RhoAshRNA的真核表達(dá)載體和對(duì)所有哺乳類基因組無(wú)任何干擾效應(yīng)對(duì)照shRNA的真核表達(dá)載體；脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染至高表達(dá)RhoA的人肝癌細(xì)胞系HepG2qh；通過(guò)篩選得到具有干擾效應(yīng)的序列載體，將該質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到HepG2中，用選擇性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定低表達(dá)RhoA基因的HepG2細(xì)胞株及正常表達(dá)RhoA基因的對(duì)照HepG2細(xì)胞株，侵襲小室(transwell)檢測(cè)這些細(xì)胞株的侵襲和遷移能力；并用染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酉h

5、(CFSE)標(biāo)記這些細(xì)胞株后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果:
　　 l、PHC癌組織和癌旁組織中均可檢測(cè)至ORhoA基因mRNA和蛋白的表達(dá)。RhoA基因mRNA和蛋白水平在PHC癌組織中的表達(dá)均較癌旁組織高，其吸光度(A)比值分別為1.45±0.66和1.18±0.53；35.74±2.38和16.50±1.53，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、分別以細(xì)胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、

6、有無(wú)淋巴結(jié)靜脈浸潤(rùn)以及有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶這些因素對(duì)PHC癌組織進(jìn)行分組比較，RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)量均具有顯著的差異(P<0.05)，說(shuō)明RhoA的表達(dá)量與PHC的細(xì)胞分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無(wú)淋巴結(jié)靜脈浸潤(rùn)以及有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶有關(guān)；而以性別和腫瘤直徑分組，RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明RhoA的表達(dá)量與性別和腫瘤直徑關(guān)聯(lián)性不大。
　　 3、在各肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC7721、HepG

7、2.2.15和HHep3B)中，RhoA mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于正常人肝胚胎細(xì)胞系LO2(P<0.05)。
　　 4、成功構(gòu)建了RhoAshRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(pshRNA—RhoAl及pshRNA—RhoA2)及對(duì)照載體(pshRNA—HK)，并在轉(zhuǎn)染HepG2后，篩選出能夠特異性抑制JRhoA基因表達(dá)的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(pshRNA—RhoA2)。
　　 5、成功建立了穩(wěn)定低表達(dá)RhoA的HepG2

8、細(xì)胞株(pshRNARhoA—HepG2)及對(duì)照HepG2細(xì)胞株(pshRNAHK—HepG2)。
　　 6、在侵襲和遷移能力實(shí)驗(yàn)中，各組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為：pshRNARhoA—HepG2組(34.1±3.2/25.2±2.1)、pshRNAHK—HepG2組(62.0±2.8/39.5±1.6)和空白細(xì)胞HepG2組(65.3±3.4/41.7±2.9)?？梢?jiàn)與HepG28目比，pshRNARhoA—HepG2侵襲和遷移能力

9、均明顯下降(P<0.05)，而pshRNAHK—HepG2去H未有明顯變化(P>0.05)，提示HepG2細(xì)胞中RhoA的表達(dá)降低后，侵襲和遷移能力均顯著降低。
　　 7、RhoAshRNA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響：pshRNARhoA—HepG2、pshRNAHK—HepG2和空白細(xì)胞HepG2分別用CFSE標(biāo)記后，流式檢測(cè)的結(jié)果顯示，pshRNARhoA—HepG2的增殖系數(shù)為40.33，而pshRNAHK—HepG2的增殖

10、系數(shù)為61.26，HepG2的增殖系數(shù)為66.15。可見(jiàn)與HepG2相比，pshRNARhoA—HepG2的增殖速度明顯減慢(P<0.05)，而pshRNAHK—HepG2的增殖速度卻沒(méi)有明顯變化(P>0.05)。說(shuō)明HepG2細(xì)胞中RhoA的表達(dá)降低后，增殖能力明顯降低。
　　 結(jié)論:RhoA基因在原發(fā)性肝癌組織中和體外肝癌細(xì)胞系中均過(guò)量表達(dá)，并與反映肝癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性的臨床病理特征密切相關(guān)，抑制肝癌細(xì)胞系中RhoA基因的表達(dá)后