CCND1擴(kuò)增對(duì)原發(fā)性乳腺癌生物學(xué)行為及內(nèi)分泌治療敏感性的影響.pdf

1、研究背景
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，居女性惡性腫瘤死亡率的首位。乳腺癌是一種多基因參與的復(fù)雜疾病，具有高度異質(zhì)性，僅憑借傳統(tǒng)的組織學(xué)特征已不能夠滿足臨床需要。近年來乳腺癌基因研究和個(gè)體化治療取得較大進(jìn)展，針對(duì)人表皮生長因子受體-2（Humanepidermalgrowthfactorreceptor-2，HER-2，CerbB-2）的靶向治療取得巨大成功，更好的認(rèn)識(shí)乳腺癌的基因改變?yōu)閭€(gè)體化治療提供了有利條件。我們前期使用定

2、量多基因熒光原位雜交(quantitativemulti-genefluorescenceinsituhybridization，QM-FISH)技術(shù)檢測(cè)乳腺癌的遺傳不穩(wěn)定性，結(jié)果顯示CCND1擴(kuò)增頻繁出現(xiàn)于乳腺癌中。CCND1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其編碼蛋白CyclinD1高表達(dá)更為普遍。目前，關(guān)于CyclinD1高表達(dá)在不同分子分型乳腺癌中的作用機(jī)制，其與雌激素受體(Estrogenreceptor，ER)陽性乳腺癌預(yù)后

3、及對(duì)內(nèi)分泌治療效果關(guān)系的結(jié)論尚不一致，尤其是CCND1擴(kuò)增與CyclinD1過表達(dá)之間的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)原發(fā)性乳腺癌病例中CCND1擴(kuò)增/CyclinD1高表達(dá)狀況;探討CyclinD1高表達(dá)對(duì)CCND1擴(kuò)增診斷的預(yù)測(cè)作用，找到與CCND1基因擴(kuò)增有關(guān)的不同CyclinD1蛋白表達(dá)水平的Cut-off值;分析CCND1擴(kuò)增/CyclinD1高表達(dá)在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)差異，探究CCND1擴(kuò)增與浸潤性乳腺癌預(yù)后及內(nèi)分泌

4、治療敏感性的關(guān)系，為CCND1成為新的乳腺癌分子標(biāo)記及治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究分為兩部分。第一部分研究CCND1擴(kuò)增與浸潤性乳腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系以及CyclinD1表達(dá)對(duì)CCND1擴(kuò)增診斷的預(yù)測(cè)作用，第二部分體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)CCND1擴(kuò)增對(duì)乳腺癌內(nèi)分泌治療敏感性的影響。
　　方法
　　第一部分:回顧分析臨床資料，免疫組織化學(xué)(immunohistochemisty，IHC)及熒光原位雜交(fluoresce

5、nceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)方法檢測(cè)217例原發(fā)性乳腺癌中CyclinD1蛋白及CCND1基因的表達(dá)情況，明確兩者在乳腺癌中的表達(dá)狀況及相關(guān)關(guān)系;分析CyclinD1在不同乳腺癌分子分型中的表達(dá)差異，進(jìn)一步探究其與乳腺癌預(yù)后及內(nèi)分泌治療敏感性的關(guān)系。
　　第二部分:利用真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和T47D，沉默CCND1基因，通過real-timePCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CCND1基因的干

6、擾效果。將實(shí)驗(yàn)組、NC(negativecontrol)組及空白對(duì)照組細(xì)胞在不同作用濃度的他莫昔芬(tamoxifen，TAM)及托瑞米芬(toremifene，TOR)中共培養(yǎng)72h，MTS法檢測(cè)細(xì)胞的抑制率，計(jì)算IC50值，檢測(cè)CCND1表達(dá)下調(diào)后乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療藥物敏感性的變化。
　　結(jié)果
　　1.217例原發(fā)性乳腺癌中有41例存在CCND1擴(kuò)增(18.9％)，CyclinD1過表達(dá)132例(60.8％);CCN

7、D1擴(kuò)增/CyclinD1過表達(dá)在浸潤性導(dǎo)管癌(Invasiveductalcarcinoma，IDC)和導(dǎo)管內(nèi)原位癌(Ductalcarcinomainsitu，DCIS)中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.CyclinD1過表達(dá)與CCND1擴(kuò)增相關(guān)(P＜0.01)，二者表達(dá)具有一致性(Kappa=0.510±0.057);ROC曲線分析示CyclinD1+++的Cut-off值為63％，CyclinD1++的C

8、ut-off值為78％。
　　3.Luminal型乳腺癌中CyclinD1高表達(dá)/CCND1擴(kuò)增率明顯高于HER-2過表達(dá)型，三陰性型乳腺癌均無CCND1擴(kuò)增;CCND1擴(kuò)增與ER陽性呈正相關(guān)，與HER-2擴(kuò)增呈負(fù)相關(guān)。
　　4.ER陽性組中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌CCND1擴(kuò)增率(40.4％)高于無淋巴結(jié)受累組(19.2％)，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)。
　　5.脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7/T47D72h后

9、CCND1的干擾效率最高(81％，86％)。
　　6.下調(diào)CCND1表達(dá)后，MCF-7/T47D-shRNA組的IC50值明顯低于MCF-7/T47D-NC組和空白對(duì)照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　1.CyclinD1過表達(dá)廣泛存在于原發(fā)性乳腺癌中，在DCIS階段即可出現(xiàn)，且在以后的各階段及轉(zhuǎn)移灶中保留下來，是乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展的一個(gè)重要因素。
　　2.CyclinD1高表達(dá)在不同的乳腺癌分子分型中存在差異，

10、CCND1擴(kuò)增與ER陽性相關(guān)，HER-2擴(kuò)增負(fù)相關(guān)，CCND1有望成為乳腺癌進(jìn)一步分類的分子標(biāo)記。
　　3.可通過免疫組化檢測(cè)CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量來預(yù)測(cè)基因擴(kuò)增情況;＞63％的腫瘤細(xì)胞呈CyclinD1+++，，提示CCND1擴(kuò)增陽性，＞78％的腫瘤細(xì)胞呈
　　CyclinD1++，，可認(rèn)為CCND1擴(kuò)增陽性。
　　4.CCND1是乳腺癌TAM耐藥的分子標(biāo)記物，對(duì)于CCND1擴(kuò)增的乳腺癌給予抗CyclinD1