GR表達(dá)條件性降低細(xì)胞模型的建立及淫羊藿苷對(duì)GR表達(dá)的影響.pdf

1、目的：聯(lián)合采用RNA干擾與Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建GR表達(dá)條件性降低的細(xì)胞模型，為在細(xì)胞水平研究GR與腎陽(yáng)虛證的關(guān)系和進(jìn)行藥物篩選建立平臺(tái)，為建立GR條件性降低的基因工程小鼠奠定基礎(chǔ)，并觀察溫腎壯陽(yáng)中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷對(duì)GR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 方法：聯(lián)合應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)及RNA干擾法建立針對(duì)目的基因GR的重組質(zhì)粒，對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒采用PCR及測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒及Cre-ERT2質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠

2、巨噬細(xì)胞RAW264.7，分別用G418及潮霉素B進(jìn)行穩(wěn)定篩選，然后用4-HT誘導(dǎo)Cre-ERT2質(zhì)粒表達(dá)，采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗(yàn)證GR在meNA及蛋白水平的表達(dá)情況；用溫腎壯陽(yáng)的中藥淫羊藿的單體成分淫羊藿苷作用于GR表達(dá)穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，然后采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗(yàn)證GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，以此來(lái)驗(yàn)證溫腎壯陽(yáng)中藥的單體成分對(duì)GR表達(dá)的調(diào)節(jié)作

3、用。 結(jié)果：成功的構(gòu)建了兩個(gè)針對(duì)目的基因GR的重組質(zhì)粒，GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)都大大降低。淫羊藿苷作用于GR表達(dá)穩(wěn)定降低的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，采用RT-PCR及Western blot的方法分別驗(yàn)證GR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析，重組質(zhì)粒PBS/U6-Neo-E(E)、PBS/U6-Neo-F(F)與對(duì)照相比，GRmRNA表達(dá)有顯著差異(P<0.01)；其中重組質(zhì)粒E的GR m