纖維連接蛋白表面修飾對促進新型聚酯材料人工韌帶生物相容性的研究.pdf

1、目的： 采用體外細胞培養(yǎng)的方法研究新型聚酯材料人工韌帶（LARS）在生物相容性，并探討采用纖維連接蛋白（Fn）表面修飾方法增進其生物相容性的有效性。 材料和方法： 首先對LARS 人工韌帶材料進行處理，在無菌操作下將其剪為7 mm×7mm 大小正方形形狀，密封包裝，紫外消毒。 將消毒處理后的部分LARS 人工韌帶材料經(jīng)堿性水解后和Fn 溶液反應(yīng)，制成表面蛋白修飾的韌帶材料供使用，處理后材料同時采用傅里葉

2、變紅外光譜分析和X 線衍射分析其化學(xué)組成。 利用改良組織塊培養(yǎng)法對SD 大鼠顱骨進行成骨細胞的原代培養(yǎng)，當(dāng)細胞長至半?yún)R合后進行傳代，傳代時用差速黏附法提純成骨細胞。然后對第2～3 代成骨細胞進行觀察和鑒定，包括倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)及生長情況、臺盼藍染色測定細胞活力、細胞堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色等染色鑒定為成骨細胞。 將2～3 代成骨細胞分別與LARS 人工韌帶支架材料（L 組）和經(jīng)纖維連接蛋白表面預(yù)處理的

3、支架材料（S 組）在體外實驗下共同培養(yǎng)，在相差顯微鏡下和掃描電子顯微鏡下觀察細胞的生長情況，并在一定的時間段分別測定成骨細胞在其黏附、生長增殖、功能能力，包括：1 細胞黏附能力測定：細胞與材料共培養(yǎng)后2h、3h、4h 后，將標(biāo)本在用掃描電鏡觀察，并計數(shù)，比較兩組材料上黏附成骨細胞數(shù)量的區(qū)別。2 細胞增殖能力測定: 細胞與材料共培養(yǎng)后0～12d,隔天采用酶消化法消化材料，分別采用細胞記數(shù)板記數(shù)法和MTT 比色法，畫出兩種材料表面細胞的生長

4、曲線。3 細胞功能測定：測定細胞與材料共培養(yǎng)后0～12d 隔天的細胞堿性磷酸酶的吸光度，根據(jù)A 值畫出兩種材料表面細胞的功能曲線。4 細胞生長情況觀察：分別在培養(yǎng)后第3，第9 天取兩組標(biāo)本拍攝掃描電鏡照片觀察細胞生長增殖情況.在培養(yǎng)12 天后，分別取兩組標(biāo)本周緣進行ALP 染色，觀察細胞與材料的生物相容性。 結(jié)果: 紅外透射光譜提示S 組材料上Fn 蛋白和材料形成了牢固的化學(xué)鍵結(jié)合，X線衍射分析結(jié)果在S 組材料上氮元素

5、含量達到了12.44％。 在細胞和材料共培養(yǎng)后，在相差顯微鏡下可見第２天起在材料的周邊可見梭形和三角形的細胞游離出，進而貼壁會合，數(shù)量逐漸增多。掃描電鏡結(jié)果顯示，細胞在接種到材料上后2h 后即有黏附效應(yīng)，隨時間推移，數(shù)量逐漸增多，S 組材料上細胞要多于L 組（p＜0.05)。細胞計數(shù)和MTT 比色結(jié)果顯示，細胞后在接種到材料后開始增殖,S 組材料和L 材料上細胞增殖基本符合正常細胞增殖曲線，S 組材料細胞對數(shù)增殖期較L 組材料

6、細胞增殖期長，且最高峰值也高（p＜0.05)。 ALP 測定發(fā)現(xiàn)細胞ALP 值隨時間推移基本穩(wěn)定，略有下降，兩組之間沒有明顯差異。（p=0.46). 掃描電鏡結(jié)果顯示，LARS人工材料具有良好的空隙結(jié)構(gòu),適合細胞的黏附和生長,L組材料和S組材料上細胞生長增殖情況良好,但S組材料上細胞在培養(yǎng)3天后即表現(xiàn)出典型的成纖維細胞狀形態(tài),9天時S組材料上細胞增殖匯合以及分泌胞外基質(zhì)情況明顯好于L組.ALP染色結(jié)果顯示在S組材料纖

7、維表面可以觀察到較L組材料明顯的染色濃聚沉積,證明細胞有更好的黏附生長。 討論: LARS人工韌帶是一種新型的聚酯材料(聚對苯二甲酸乙二酯,PET) 人工韌帶,具有良好的力學(xué)性能, 但據(jù)文獻報道[1 2]PET材料的分子結(jié)構(gòu)對稱,結(jié)晶度較高,親水性較差,其生物相容性如何仍受到質(zhì)疑。 我們采用將韌帶支架材料表面水解的方法后和高濃度的Fn蛋白溶液反應(yīng),形成PET-Fn材料,以期提高其生物相容性。材料學(xué)檢測結(jié)果證實了

8、蛋白和材料表面修飾的有效性。細胞和材料的共培養(yǎng)實驗表明,細胞在LARS人工韌帶表面能夠黏附增殖分化,具有一定的功能.采用蛋白表面修飾的LARS韌帶材料,效果更佳。掃描電鏡照片和ALP染色結(jié)果也證實了這一點,推測這與采用蛋白表面修飾改變材料的相關(guān)理化特性，有利于細胞黏附,同時Fn蛋白作為細胞黏附蛋白,有效的增進了細胞與材料的黏附效應(yīng),進而促進了細胞的增殖。 結(jié)論: LARS人工韌帶作為一種新型的聚酯材料人工韌帶,在體外細胞