PTPLAD2在食管鱗狀細胞癌中的表達及其相關(guān)功能的初步研究.pdf

1、研究背景:酪氨酸蛋白磷酸酶樣A結(jié)構(gòu)域2(protein tyrosine phosphatase-like A domain containing2,PTPLAD2),也被稱為3-羥?；o酶A脫氫酶4(3-hydroxyacyl-CoA dehydratase4,HACD4),是含有232個氨基酸的6次跨膜蛋白,屬 HACD極長鏈脂肪酸脫水蛋白家族成員,PTPLAD2與酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphat

2、ases,PTP)家族成員有相似結(jié)構(gòu),PTP家族成員受體蛋白結(jié)構(gòu)高度保守,其中多個分子已證實與腫瘤的發(fā)生有關(guān),但迄今為止PTP家族蛋白在腫瘤形成中的作用機理尚未明確。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)是一種可以被細胞膜信號直接誘導(dǎo)進入細胞核活化基因轉(zhuǎn)錄的蛋白,當STAT被磷酸化后(p-STAT),發(fā)生聚合成為同源或異源二聚體形式的活化的轉(zhuǎn)錄

3、激活因子,進入胞核內(nèi)與靶基因啟動子序列的特定位點結(jié)合,促進其轉(zhuǎn)錄。在STAT家族蛋白中,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)被認為是大量癌基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯聚點,并且該蛋白控制著多種促炎因子和生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,STAT3可參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展,已有文獻在體內(nèi)、體外實驗中證實其可以促進食管鱗狀細胞癌(esophageal squa

4、mous cell carcinoma,ESCC)的增殖和侵襲。基于前期激光顯微捕獲切割和Affymetrix SNP6.0芯片結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)PTPLAD2基因在食管鱗狀細胞癌中存在高頻率雜合性丟失(loss of heterozygosity,LOH),提示PTPLAD2可能是食管鱗狀細胞癌發(fā)生相關(guān)的新的潛在抑癌基因。在本研究中,我們通過免疫組化方法檢測食管鱗狀細胞癌組織中PTPLAD2蛋白及p-STAT3蛋白的表達和定位情況,進一步

5、分析PTPLAD2和p-STAT3的表達與食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后以及食管鱗狀細胞癌臨床病理特點之間的關(guān)系;并在體內(nèi)和體外實驗中研究PTPLAD2及STAT3在HET-1A細胞、Eca-109細胞增殖中的作用及它們之間可能存在的相互作用機制,對PTPLAD2在食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制進行了初步探討。
　　方法:首先,研究食管鱗狀細胞癌組織及正常食管上皮組織中PTPLAD2和p-STAT3的表達:
　　(1)采用q

6、RT-PCR和免疫印跡等方法檢測PTPLAD2在食管鱗狀細胞癌組織以及正常食管鱗狀上皮中的表達;
　　(2)采用免疫組化方法檢測PTPLAD2和p-STAT3在食管鱗狀細胞癌組織及正常食管鱗狀上皮中的表達和定位;
　　(3)根據(jù)隨訪資料分析PTPLAD2及p-STAT3的表達與食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后的關(guān)系;
　　(4)應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件分析PTPLAD2及p-STAT3的表達和食管鱗狀細胞癌組織分化程度、浸潤深度以及是否有

7、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　隨后,通過體內(nèi)和體外實驗對PTPLAD2和STAT3在細胞增殖中的作用進行了研究:
　　(1)將shRNA against PTPLAD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HET-1A(NIH/3T3)細胞,抑制HET-1A(NIH/3T3)細胞內(nèi)PTPLAD2基因的表達,觀察HET-1A(NIH/3T3)細胞增殖變化情況;
　　(2)將過表達PTPLAD2質(zhì)粒(pcDNA-PTPLAD2)轉(zhuǎn)染進入Eca-10

8、9細胞后,觀察Eca-109細胞增殖變化情況;
　　(3)將STAT3-CA(可使STAT3過度激活)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HET-1A細胞,激活STAT3的活性,觀察HET-1A細胞增殖變化情況;
　　(4)將shRNA against STAT3轉(zhuǎn)染進入Eca-109細胞,使得STAT3基因沉默,抑制Eca-109細胞內(nèi)STAT3基因的表達,觀察 Eca-109細胞增殖變化情況;
　　(5)在小鼠皮下接種轉(zhuǎn)染pcDNA-PT

9、PLAD2質(zhì)粒的Eca-109細胞,觀察裸鼠成瘤情況;
　　(6)在小鼠皮下接種STAT3基因沉默的Eca-109細胞,觀察裸鼠成瘤變化情況。
　　最后用免疫印跡方法檢測在細胞內(nèi)當PTPLAD2表達水平改變后,STAT3水平、STAT3磷酸化水平以及STAT3上下游作用分子的蛋白水平變化情況,對PTPLAD2和STAT3對細胞增殖影響可能相互作用機制進行了初步研究。
　　結(jié)果:1、相對于正常食管鱗狀上皮,食管鱗狀細胞癌

10、組織中PTPLAD2的表達降低,而 p-STAT3的表達升高:
　　(1)食管鱗狀細胞癌組織中檢測出PTPLAD2的mRNA水平及蛋白的表達水平均降低。同時食管癌細胞系Eca-109細胞中PTPLAD2蛋白的表達水平也低于其在正常食管細胞系HET-1A細胞中的表達水平;
　　(2)通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細胞癌組織中PTPLAD2的表達主要分布在腫瘤細胞膜,而 p-STAT3的表達主要分布在細胞核;
　　(3)隨訪

11、結(jié)果顯示食管鱗狀細胞癌組織中PTPLAD2的表達水平與患者的預(yù)后呈正相關(guān),PTPLAD2表達水平越高的患者預(yù)后越好,而p-STAT3的表達水平則與患者的預(yù)后呈負相關(guān),p-STAT3表達水平越高的患者預(yù)后越差;
　　(4)對食管鱗狀細胞癌組織及正常食管上皮組織免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果顯示相對在正常組織中的表達,PTPLAD2在食管鱗狀細胞癌組織中表達陽性率較低,腫瘤分化越差、浸潤越深以及伴有淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的病例表達越低

12、,而p-STAT3在食管鱗狀細胞癌組織中表達陽性率較高,腫瘤分化越差、浸潤越深的病例表達越高。
　　2、通過體內(nèi)及體外實驗對PTPLAD2和STAT3在HET-1A細胞和Eca-109細胞中的功能進行了初步的研究:
　　(1)抑制HET-1A和NIH/3T3細胞內(nèi)PTPLAD2基因的表達,MTT和集落形成實驗顯示HET-1A和NIH/3T3細胞的增殖能力增加;
　　(2)將pcDNA- PTPLAD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入Eca

13、-109細胞后,MTT和集落形成實驗證實Eca-109細胞的增殖能力明顯降低;
　　(3)將HET-1A細胞內(nèi)STAT3活性激活后,MTT和集落形成實驗證實 HET-1A細胞的增殖能力增加;
　　(4)抑制Eca-109細胞內(nèi)STAT3基因的表達,MTT和集落形成實驗證實Eca-109細胞的增殖能力減低;
　　(5)在小鼠皮下接種轉(zhuǎn)染pcDNA-PTPLAD2質(zhì)粒的Eca-109細胞,裸鼠皮下成瘤受到抑制;
　　

14、(6)在小鼠皮下接種STAT3基因沉默的Eca-109細胞,裸鼠皮下成瘤受到抑制。
　　3、食管鱗狀細胞癌中PTPLAD2和STAT3相互作用機制的研究:
　　(1)PTPLAD2表達水平的改變可以影響 STAT3的磷酸化水平,但對調(diào)控 STAT3基因的上游分子沒有明顯影響;
　　(2)PTPLAD2表達水平的改變可以影響STAT3下游基因FOXM1的表達水平。
　　結(jié)論:
　　(1)相對于正常食管鱗狀上皮

15、,PTPLAD2在食管鱗狀細胞癌中的表達降低,PTPLAD2可能是食管鱗狀細胞癌發(fā)生相關(guān)的新的潛在抑癌基因;
　　(2)PTPLAD2的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者的預(yù)后呈正相關(guān);癌組織中PTPLAD2蛋白表達水平高的食管鱗狀細胞癌患者預(yù)后好,而p-STAT3蛋白則相反,癌組織p-STAT3蛋白表達水平高的患者預(yù)后差;
　　(3)PTPLAD2可以抑制細胞的增殖,這種抑制作用可能是通過降低STAT3的磷酸化水平,從而降低其活