小鼠胚胎玻璃化冷凍對(duì)子代發(fā)育影響的初步研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：研究玻璃化冷凍對(duì)小鼠胚胎體內(nèi)外發(fā)育潛能的影響
　　 目的：
　　 觀察新鮮6～8-細(xì)胞胚胎和玻璃化冷凍復(fù)蘇6～8-細(xì)胞胚胎在囊胚形成率、囊胚孵出率及妊娠率、小鼠出生率的差異，初步探討玻璃化冷凍對(duì)胚胎體內(nèi)外發(fā)育潛能的影響。
　　 方法：
　　 共取性成熟期雌鼠（大于6～7周齡）200只。同籠雌鼠于見(jiàn)陰栓后20小時(shí)脫頸處死，取2-細(xì)胞胚胎。取胚后36小時(shí)左右觀察胚胎

2、，將6～8細(xì)胞胚胎分為兩組，一組新鮮胚胎進(jìn)行移植（新鮮移植組），一組進(jìn)行玻璃化冷凍（玻璃化冷凍組）2周后復(fù)蘇移植。
　　 兩組各取50枚移植前胚胎，體外培養(yǎng)48～72小時(shí)，觀察兩組胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚、及囊胚孵出的情況。
　　 復(fù)蘇后的6～8-細(xì)胞胚胎經(jīng)1～3 h培養(yǎng)，選擇外形正常的胚胎移植于假孕63～67 h的受體母鼠的兩側(cè)子宮中，每側(cè)8枚。新鮮移植組為新鮮6～8-細(xì)胞胚胎移植。妊娠17～20 d自然分娩后記錄產(chǎn)仔數(shù)

3、。對(duì)兩組妊娠率、小鼠出生率進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.新鮮移植組和玻璃化冷凍組胚胎一般情況觀察：新鮮移植組共獲823枚6～8細(xì)胞優(yōu)質(zhì)胚胎。玻璃化冷凍組共獲1156枚6～8細(xì)胞優(yōu)質(zhì)胚胎，冷凍1143枚胚胎，復(fù)蘇后存活胚胎為884枚。復(fù)蘇成活率為77.34%。
　　 2.新鮮移植組和玻璃化冷凍組胚胎囊胚形成率、囊胚孵出率的比較：兩組各取50枚移植前胚胎，體外培養(yǎng)觀察，新鮮移植組形成囊胚46枚，囊胚形成率為

4、92%；孵出囊胚42枚，囊胚孵出率為84%。玻璃化冷凍組形成囊胚45枚，囊胚形成率為90%；孵出囊胚43枚，囊胚孵出率為86%。兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3.新鮮移植組和玻璃化冷凍組妊娠率的比較：新鮮移植組移植假孕鼠47只，妊娠23只，妊娠率為48.93%；玻璃化冷凍組移植假孕鼠51只，妊娠24只，妊娠率為47.06%。兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4.新鮮移植組和玻璃化冷

5、凍組仔鼠出生率的比較：新鮮移植組共移植胚胎752枚，分娩子代99只，出生率為13.16%；玻璃化冷凍組共移植胚胎816枚，分娩子代103只，出生率為12.62%。兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 玻璃化冷凍復(fù)蘇后，成活胚胎囊胚形成率、囊胚孵出率及移植后的妊娠率，仔鼠出生率，與新鮮胚胎相比無(wú)明顯差異。說(shuō)明玻璃化冷凍對(duì)胚胎體內(nèi)外發(fā)育潛能無(wú)明顯影響。
　　 第二部分：研究玻璃化冷凍對(duì)子代一

6、般發(fā)育情況的影響
　　 目的：
　　 對(duì)新鮮移植組和玻璃化冷凍組子代小鼠的生理發(fā)育、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能、器官畸形發(fā)病率進(jìn)行觀察，進(jìn)一步探討胚胎玻璃化冷凍對(duì)子代發(fā)育的影響。
　　 方法：
　　 1.仔鼠出生當(dāng)天定為出生后0d。記錄新生小鼠體重，仔鼠耳廓分離、上下牙萌出、張耳、睜眼、睪丸下降、陰道開(kāi)口、全身絨毛、全身白毛等生理發(fā)育指標(biāo)；平面翻正、前肢懸掛、爬行、空中翻正等神經(jīng)反射和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能指標(biāo)。
　　

7、 2.兩組均于出生后第3天，第7天，第14天，第21天，第28天，第60天分別取雌雄小鼠各6只，脫頸處死，解剖后觀察各器官發(fā)育情況。
　　 3.兩組均于上述時(shí)間段分別取小鼠子宮、卵巢、睪丸，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，行HE染色。進(jìn)一步觀察小鼠生殖器官發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化，每個(gè)時(shí)間段雌雄小鼠各6只。
　　 結(jié)果：
　　 1.生長(zhǎng)發(fā)育：兩組新生仔鼠平均體重分別為1.42±0.26g，1.39±0.38g。兩組小鼠

8、生理發(fā)育和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)指標(biāo)測(cè)試結(jié)果提示兩組小鼠發(fā)育無(wú)明顯異常。
　　 2.大體解剖：玻璃化冷凍組共出生103只仔鼠，其中雄鼠58只。有一只子代解剖后可見(jiàn)雄性生殖器官發(fā)育正常，但副中腎管無(wú)完全退化，呈白色羊角樣。該鼠染色體分析為40，XY。故認(rèn)為是雄性畸形，畸變?cè)蛭粗?。余器官未?jiàn)明顯畸形。新鮮移植組共出生99只仔鼠，其中雄鼠56只，各器官均未見(jiàn)明顯畸形。
　　 3.生殖器官形態(tài)學(xué)觀察：兩組小鼠在上述相應(yīng)時(shí)期，子宮、卵巢、睪丸

9、發(fā)育中均未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)異常。
　　 結(jié)論：
　　 玻璃化冷凍不影響小鼠的生理及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的發(fā)育。但對(duì)出現(xiàn)的小鼠生殖管道畸形的原因，需要進(jìn)一步研究。
　　 第三部分：研究玻璃化冷凍對(duì)雌性子代子宮發(fā)育的影響
　　 目的：
　　 通過(guò)比較兩組子代子宮發(fā)育過(guò)程中，Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因的表達(dá)，進(jìn)一步研究玻璃化冷凍復(fù)蘇過(guò)程對(duì)雌性小鼠子宮形態(tài)和功能的影響。

10、r>　　 方法：
　　 1.兩組均于生后第3天，第7天，第14天，第21天，第28天，第60天取雌性小鼠各6只，分別取其子宮。取其中3只，左側(cè)子宮固定行免疫組化，右側(cè)行PCR，另3只欲行Western-blot。
　　 2.用于免疫組化的子宮固定，石蠟包埋，水平橫切面切成4μm切片，行Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因蛋白免疫組化染色。
　　 3.兩組上述不同時(shí)間段的小

11、鼠子宮，PCR及Western-blot進(jìn)一步研究Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catinin、Hoxa10基因、蛋白在子代子宮發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果：
　　 Wnt4表達(dá)僅限于腔上皮和鄰近子宮腺體之間的基質(zhì)。Wnt5a在基質(zhì)內(nèi)呈強(qiáng)表達(dá)，在腔上皮和腺上皮內(nèi)弱表達(dá)。Wnt7a在腔上皮和腺上皮內(nèi)表達(dá)。Β-catenin在子宮內(nèi)膜上皮及基質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)。Hoxa10主要在基

12、質(zhì)及子宮肌層內(nèi)表達(dá)。對(duì)Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、β-catenin和Hoxa10 在兩組相應(yīng)時(shí)期的免疫反應(yīng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組相應(yīng)時(shí)期的平均密度值無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果
　　 RT-PCR結(jié)果顯示:Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Hoxa10、β-catenin在兩組子代子宮發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá)，在上述相應(yīng)時(shí)期表達(dá)無(wú)明顯差異 (P＞0.05)。
　　 3.Weste