雌激素及ARA55對TGFβ1的調節(jié)在前列腺中作用的研究.pdf

1、良性前列腺增生癥(BPH)是老年男性泌尿外科的常見疾病。前列腺由腺泡和間質兩部分組成。BPH組織中，間質與上皮和平滑肌細胞在問質細胞中的比例均明顯高于正常前列腺組織，因此BPH是一種以間質增生為主的疾病。前列腺間質主要由平滑肌細胞和成纖維細胞組成。在BPH研究中，一個主要障礙是缺乏合適的細胞模型。由于前列腺間質細胞具有異質性，不同研究者使用的培養(yǎng)體系中，平滑肌和成纖維細胞的比例不同，導致不同研究者的結論常常會出現矛盾。 本實驗室

2、以前曾報道過前列腺平滑肌細胞的培養(yǎng)模型，然而，由于平滑肌細胞在體外培養(yǎng)中逆分化為成纖維細胞，即使采用平滑肌細胞選擇性培養(yǎng)液，也不能在體外培養(yǎng)中獲得純的前列腺平滑肌細胞。由于平滑肌細胞和成纖維細胞表達不同的活性因子，它們的自分泌和旁分泌作用可以影響前列腺間質和上皮的增殖和分化。因此，獲得純的平滑肌細胞和成纖維細胞，研究兩種細胞基因表達的差異性和激素和相關生長因子對其調節(jié)作用，為前列腺增生的病因學提供新的思路和靶點，這對于前列腺增生的分子病

3、因學研究具有重要的意義。 近年來越來越多的研究表明，雌激素可能參與了前列腺腺體的自穩(wěn)調節(jié)和間質增生的形成。轉化生長因子β1(TGFβ1)是一種具有多功能生物學活性的細胞因子，它不但在調節(jié)細胞的生長、分化、凋亡、胚胎發(fā)生和組織修復、炎癥反應及纖維化中起著重要的作用，而且對前列腺細胞黏附、細胞外基質合成與蓄積有著重要的調節(jié)作用。基質金屬蛋白酶是一類在生理條件下能降解細胞外基質和基底膜組分的蛋白，在前列腺不同類型細胞中，基質金屬蛋白酶

4、存在差異表達?；|金屬蛋白酶．2(MMP-2)是前列腺間質中主要表達的一種基質金屬蛋白酶。有研究表明，在鼠前列腺中雄激素可以抑制TGFβ1及其受體的表達；在前列腺癌中，雄激素對多種基質金屬蛋白酶的表達有促進作用。有報道指出，在BPI{患者血清和前列腺組織中，基質金屬蛋白酶2(MMP-2)的蛋白水平升高，由于老年男性血漿和前列腺組織中雌/雄激素比例和雌激素受體均明顯增加，在增生的前列腺中的TGFβ1表達明顯增加，因此研究雌激素和TGFβ1

5、對前列腺問質細胞MMP-2的調節(jié)作用對進一步了解前列腺增生發(fā)生和發(fā)展的分子機制有重要的意義。輔助調節(jié)因子是類固醇激素和配體結合后募集的轉錄調節(jié)因子，輔助調節(jié)因子包括輔助激活因子和輔助抑制因子，分別對類固醇激素受體的轉錄活性具有上調或下調作用，從而調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡等生物學表型。雄激素受體輔助調節(jié)因子ARA55最初克隆自人前列腺cDNA文庫，它可以與AR相互作用，還與許多細胞內蛋白(比如熱休克蛋白hsp27，酪氨酸激酶PYK2等)

6、結合，并調節(jié)不同的信號傳導途徑。 另有文獻報道，TGFpl可以上調ARA55的表達。我們發(fā)現在不表達雄激素受體的前列腺癌細胞系DU．145中有ARA55的表達，而且過表達ARA55可以抑制DU-145細胞的增殖。由于TGFβ1可以抑制前列腺癌細胞增殖，探討在不表達雄激素受體的DU-145細胞中ARA55的作用及其與TGFβ1的關系，可為進一步闡明類固醇激素受體輔助調控因子表達異常在前列腺癌病變發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供重要的線索

7、。 方法：論文第一部分，克隆SM22啟動子，并構建不同長度的SM22啟動子調節(jié)的熒光素酶報告質粒，通過測定用平滑肌細胞選擇性培養(yǎng)液和普通間質細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的前列腺間質細胞中的熒光素酶活性，選擇具有平滑肌細胞特異性而且具有較高活性的SM22啟動子片斷。將平滑肌細胞特異性的SM22啟動子片斷克隆到紅綠熒光報告載體中，在此載體上，紅色熒光蛋白(RFP)的表達受平滑肌細胞特異性的SM22啟動子片斷的調控，綠色熒光蛋白(GFP)受CMV啟

8、動子控制，是組成型表達的。我們采用了基于啟動子特異性激活紅綠色熒光蛋白表達，并采用流式細胞分選的策略，用流式細胞儀分選出GFP+/RFP+和GFP+/RFP-細胞，即純的平滑肌細胞和成纖維細胞。而后，提取總RNA，進行實時定量RT-PCR，并研究基因表達差異。 論文第二部分，體外培養(yǎng)前列腺平滑肌細胞系WPMY-1，添加入不同濃度的雌激素和TGFβ1，用實時定量RT-PCR方法分別測定TGFβ1和MMP-2的mRNA水平的表達，并

9、用ELISA的方法測定培養(yǎng)液中TGFβ1的蛋白水平，用酶譜電泳的方法測定MMP-2的活性?？寺MP-2基因的啟動子調節(jié)的熒光素酶報告基因，瞬時轉染前列腺平滑肌細胞系WPMY-1，并進行啟動子活性分析，研究轉錄水平的調節(jié)作用。用TGFβ1中和抗體阻斷TGFβ1信號途徑，研究雌激素和TGFβ1對于MMP-2表達的分子機理。用放線菌素D和放線菌酮處理細胞，分別阻止mRNA和蛋白的合成的方法研究TGFβ1對于MMP-2表達的分子機理。

10、 論文第三部分，用RT-PCR的方法測定不同類型的前列腺細胞系和前列腺癌與癌旁組織中一些類固醇受體輔助調節(jié)因子(包括AIB1，ARA54，ARA55，ARA70，BRCAl，CBP，NCOR1，P68，P300，PCAF，SMRT，SRA，SRCl，TIF2等)的mRNA水平的差異表達情況。選定前列腺癌細胞系中表達低的ARA55為研究對象，克隆其基因表達載體和小干擾RNA表達載體，建立穩(wěn)定轉染ARA55的前列腺癌細胞系DU-145。采用

11、MTT的方法研究ARA55過表達對DU-145增殖的影響。采用實時定量RT-PCR和ELISA的方法分別測定TGFβ1的mRNA水平和蛋白水平。采用TGFβ1中和抗體阻斷TGFβ1信號途徑，研究ARA55抑制DU-145細胞系增殖的分子機理?？寺GFβ1的啟動子，采用熒光素酶報告基因研究ARA55對TGFβ1啟動子的作用。 結果：論文第一部分，成功克隆了SM22啟動子，并連接到熒光素酶報告質粒中，測定不同長度截短的SM22啟動

12、子用平滑肌細胞選擇性培養(yǎng)液和普通間質細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的前列腺間質細胞中的活性。結果表明，SM22轉錄起始點到上游-1396bp的SM22啟動子片斷具有平滑肌細胞特異性而且具有較高的活性。將構建的紅綠熒光蛋白的表達載體轉染原代前列腺間質細胞，部分細胞同時表達紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白，部分細胞只表達綠色熒光蛋白，這分別代表成功轉染的前列腺平滑肌細胞和成纖維細胞。通過流式細胞儀，可以在體外分離同時表達紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的細胞群和只表達

13、綠色熒光蛋白的細胞群。實時定量RT-PCR結果表明，經流式細胞儀分離的細胞為純的平滑肌細胞和成纖維細胞。而且，雌激素受體和TGFβ1在前列腺平滑肌細胞中的表達比成纖維細胞高10倍以上。 論文第二部分，雌激素和TGFβ1均可以促進體外培養(yǎng)的前列腺平滑肌細胞系WPMY-1的MMP-2蛋白水平的表達，但對MMP-2的mRNA水平沒有影響。進一步研究其作用機制發(fā)現，雌激素可以促進TGFβ1的表達，而且雌激素對MMP-2蛋白水平的促進作用

14、可以被TGFβ1中和抗體阻斷，提示，雌激素對MMP-2蛋白水平的促進作用是通過TGFβ1實現的。進一步研究TGFβ1對MMP-2上調的作用機制結果表明，TGFβ1不能促進MMP-2的啟動子活性，而且，TGFβ1對于MMP-2表達的促進作用可以被放線菌酮抑制，但不能被放線菌素D抑制，提示，TGFβ1對于MMP-2表達的促進作用是轉錄后調節(jié)的機制。 論文第三部分，在本文研究的類固醇受體輔助調節(jié)因子中，ARA55的表達水平在前列腺癌細

15、胞系中明顯低于非癌細胞系；在前列腺癌組織中表達水平低于癌旁組織。提示，ARA55的表達下調與前列腺癌相關。分別克隆了ARA55的基因和小干擾RNA表達載體，并建立了ARA55的基因和小干擾RNA表達載體穩(wěn)定轉染的前列腺癌DU-145細胞系。MTT結果表明，ARA55過表達可以抑制DU-145細胞的增殖。實時PCR的結果顯示，TGFIβ1可以上調ARA55的表達：ELISA結果顯示，ARA55過表達可以促進TGFβ1的表達；而且ARA55

16、對DU-145增殖的抑制作用可以部分被TGFβ1中和抗體阻斷，提示，ARA55抑制增殖的作用是部分通過TGFβ1而實現，但可能還有其他途徑。 結論：用基于平滑肌細胞特異性標記蛋白SM22啟動子特異性激活熒光蛋白表達并在體外采用流式細胞儀的方法可以成功的分選前列腺平滑肌細胞和成纖維細胞；比較分離的前列腺平滑肌細胞和成纖維細胞基因表達差異結果表明，雌激素受體和TGFβ1主要在前列腺平滑肌細胞中表達，提示，雌激素受體和TGFβ1在維持

17、前列腺平滑肌細胞的表型中具有重要作用。 闡明了雌激素通過促進TGFβ1的表達并以轉錄后調節(jié)的方式上調體外培養(yǎng)前列腺平滑肌細胞系WPMY-1的MMP-2蛋白水平的分子機制，提示，雌激素促進前列腺間質增生和抑制前列腺癌的轉移方面有一定的作用。 ARA55在前列腺癌中低表達；TGFβ1可上調ARA55的表達，ARA55又可通過促進TGFβ1的表達部分抑制前列腺癌細胞系DU-145的增殖。提示ARA55在前列腺癌中不是以雄激素輔