慢性缺血缺氧在前列腺增生發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、研究目的:BPH是老年男性常見病與多發(fā)病,嚴(yán)重影響老年男性患者生活質(zhì)量,病因未明。近年來越來越多研究提示BPH與下尿路慢性缺血改變存在著密切關(guān)系,下尿路慢性缺血可能是BPH病因之一。本研究旨在進(jìn)一步探討局部缺血缺氧在BPH發(fā)病機(jī)制中的作用,冀希望通過本研究達(dá)到以下目的:
　　 1、通過臨床流行病學(xué)研究深化血管損害因素與BPH之間關(guān)系；精確測(cè)量前列腺組織內(nèi)血流情況并通過橫向與縱向比較進(jìn)一步驗(yàn)證BPH局部組織缺血情況；
　　

2、 2、制造下尿路缺血兔模型,觀察前列腺缺血后改變；聯(lián)合下尿路缺血及BOO兩種因素觀察膀胱改變情況；
　　 3、觀察缺氧條件下前列腺間質(zhì)及上皮細(xì)胞增殖與凋亡變化情況,進(jìn)一步研究缺氧條件下間質(zhì)及上皮細(xì)胞生長因子分泌及受體表達(dá)的變化。
　　 研究方法:
　　 1、收集我科經(jīng)治BPH患者血管損害相關(guān)因素(高血壓、糖尿病、吸煙、高血脂、年齡)及前列腺癥狀資料(前列腺體積、IPSS評(píng)分、前列腺梗阻程度),采用多等級(jí)資料Log

3、istic回歸分析進(jìn)行分析。
　　 經(jīng)直腸CDUS檢測(cè)56例BPH患者及12例年輕志愿者前列腺移行帶血管阻力指數(shù)及血流灌注量,比較兩組之間前列腺移行帶血管阻力指數(shù)及血流灌注量之間差異,并就BPH患者兩側(cè)前列腺移行帶體積之間差異與其血管阻力指數(shù)及血流灌注量之間差異進(jìn)行相關(guān)分析。
　　 2、40只成年新西蘭兔隨機(jī)分為5組,每組8只,其中4只采用半縫扎腹主動(dòng)脈方法制造前列腺組織缺血模型,剩余4只為假手術(shù)對(duì)照。于術(shù)后第1,2,4

4、,8,12周各取1組觀察前列腺重量,并將前列腺組織石蠟切片HE染色后觀察鏡下改變,Ki67染色觀察前列腺組織內(nèi)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增殖情況,原位末端標(biāo)記法檢測(cè)前列腺組織內(nèi)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況。
　　 另取32只成年新西蘭兔隨機(jī)分為2組,其中兩組每組16只,一組制造膀胱出口梗阻模型,另一組制造缺血合并梗阻模型。結(jié)合前組假手術(shù)對(duì)照及單純?nèi)毖M,于術(shù)后第1,2,4,8周各取1組測(cè)量膀胱濕重,膀胱全層石蠟切片MASON染色觀察粘膜層

5、、粘膜下層、肌層及漿膜層厚度并分析膀胱間質(zhì)平滑肌與膠原成分含量變化,S-100染色分析組織內(nèi)神經(jīng)原變化情況。檢測(cè)膀胱肌層組織中肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶與檸檬酸鹽合酶活性。
　　 3、前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1及間質(zhì)細(xì)胞株WPMY-1購自美國ATCC,培養(yǎng)傳代2代細(xì)胞性狀穩(wěn)定后,細(xì)胞以1×104、5×104、1×105/ml濃度,每孔100μl接種于72孔板,MTS法描記細(xì)胞生長曲線。
　　 上皮細(xì)胞混懸液以5×106/ml細(xì)

6、胞濃度接種于6孔板,每孔3ml。分別置于缺氧及有氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)4、8、12、24、48小時(shí)后收獲細(xì)胞,用RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞HIF-1α、AR、ER、EGFR-1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R、EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1mRNA表達(dá)；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1含量；制備細(xì)胞爬片,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞上AR、ER

7、、EGFR-1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R蛋白表達(dá)情況；間質(zhì)細(xì)胞以3×106/孔接種6孔板,實(shí)驗(yàn)方法同前。
　　 75cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)上皮細(xì)胞貼壁80～90％,棄上清液,加入間質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基20ml/瓶,分別于有氧和缺氧條件下培養(yǎng)24小時(shí),收集上清液離心去除細(xì)胞殘?jiān)４?。有氧條件下制備為間質(zhì)有氧條件培養(yǎng)基,無氧條件下制備為間質(zhì)無氧條件培養(yǎng)基。比較在12、24和48小時(shí)間質(zhì)在有氧條件培養(yǎng)基、無氧

8、條件培養(yǎng)基以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基環(huán)境中分別置于有氧及缺氧條件下培養(yǎng),細(xì)胞增殖與凋亡之間差異。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、單因素資料分析,在病變程度不同的各組間比較,隨高危因素程度或病例百分率增加,BPH病變程度增加。多因素資料采用分級(jí)變量Logistic分析顯示2型糖尿病在前列腺大小、IPSS評(píng)分及梗阻程度中均為最顯著的獨(dú)立相關(guān)因素(OR分別為3.179,3.862,2.847,P均<0.001),血清甘油三脂在前列腺大小、I

9、PSS評(píng)分及梗阻程度中均非顯著的相關(guān)獨(dú)立因素(P均>0.05),年齡、高血壓、高血脂和吸煙均是上述BPH病變程度顯著相關(guān)獨(dú)立因素。
　　 BPH患者前列腺移行帶血管阻力指數(shù)平均為0.84,高于年輕志愿者(0.55),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而BPH患者移行帶血流灌注量低于年輕志愿者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；BPH患者兩側(cè)移行帶體積差異與兩側(cè)移行帶血管阻力指數(shù)之間差異呈正相關(guān)(r=0.713,P=0.001

10、)；與兩側(cè)移行帶血流灌注量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.534,P=0.004)。年輕志愿者兩側(cè)前列腺移行帶體積、血管阻力指數(shù)及血流灌注量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　 2、缺血4周后兔前列腺重量為1.754±0.563g,8周后為2.836±0.517g,12周后為4.551±0.622g,均高于同期假手術(shù)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。缺血1周后前列腺間質(zhì)細(xì)胞Ki67染色開始增加,同時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)下降,與同期假手術(shù)對(duì)照組比較差異

11、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。前列腺上皮細(xì)胞在缺血2周Ki67染色開始增加且凋亡細(xì)胞數(shù)下降。缺血合并BOO組膀胱重量較同期單純BOO組減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血合并BOO組間質(zhì)成分于術(shù)后即開始顯著增加,前2周平滑肌成分亦有顯著增加并達(dá)峰值。而單純BOO組術(shù)后前4周主要表現(xiàn)為膀胱平滑肌代償增加并達(dá)峰值,間質(zhì)成分于第4周開始顯著增加。S-100染色神經(jīng)元標(biāo)志提示單純梗阻組于術(shù)后2周開始出現(xiàn)斑片狀去神經(jīng)支配區(qū)域,且神經(jīng)染色強(qiáng)度隨時(shí)間延長

12、而顯著降低,單純?nèi)毖M于術(shù)后第1周即出現(xiàn)去斑片狀去神經(jīng)支配區(qū)域,但隨后神經(jīng)染色強(qiáng)度并無顯著差異。而缺血合并BOO組于術(shù)后第一周即開始出現(xiàn)斑片狀去神經(jīng)支配區(qū)域,神經(jīng)染色強(qiáng)度隨時(shí)間延長而顯著減低。對(duì)照組無此病理變化。單純?nèi)毖MSERCA與檸檬酸合酶表達(dá)均呈逐漸下降趨勢(shì),但術(shù)后第二周始下降程度減輕。而單純BOO組術(shù)后第一周即顯著下降,術(shù)后第二、第四周上升,至第八周再次出現(xiàn)顯著下降。缺血合并BOO組術(shù)后第一周顯著下降,第二周升至峰值后隨時(shí)間變化

13、顯著下降。
　　 3、缺氧培養(yǎng)前列腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞RT-qPCR顯示其HIF-1α、AR、ER、EGFR—1、VEGFR-1、TGF—βR1、bFGFR-1、IGF-1R、EGF、VEGF、TGF-β、bFGF、IGF-1 mRNA表達(dá)均隨時(shí)間增加而增加,有氧條件下培養(yǎng)HIF-1α基因未檢測(cè)到表達(dá),上述基因表達(dá)與同期缺氧條件下比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示前列腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞AR、ER、EGFR-

14、1、VEGFR-1、TGF-βR1、bFGFR-1、IGF-1R在無氧條件下培養(yǎng)較同期有氧條件下培養(yǎng)均顯著增加。
　　 ELISA顯示無氧條件下培養(yǎng)上皮細(xì)胞分泌TGF-β增加,而間質(zhì)細(xì)胞分泌EGF、VEGF、TGF-β、bFGF均顯著增加。
　　 同時(shí)間段前列腺上皮細(xì)胞在無氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞增殖最高,凋亡細(xì)胞數(shù)最低,其后依次為有氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境、無氧條件培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)環(huán)境、有氧條件培養(yǎng)基有氧培養(yǎng)環(huán)境,

15、而在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,無論培養(yǎng)環(huán)境有氧無氧,細(xì)胞增殖不明顯。
　　 同時(shí)間段前列腺間質(zhì)細(xì)胞在有氧條件培養(yǎng)基無氧培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞增殖最高,凋亡細(xì)胞數(shù)最低,其后依次為無氧條件培養(yǎng)基無氧環(huán)境、基礎(chǔ)培養(yǎng)基無氧環(huán)境、無氧條件培養(yǎng)基有氧環(huán)境、有氧條件培養(yǎng)有氧環(huán)境、基礎(chǔ)培養(yǎng)基有氧環(huán)境(細(xì)胞增殖不明顯)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、BPH病變程度與血管損害因素之間存在相關(guān)性,且BPH患者前列腺移行帶存在缺血性改變,其缺血性改變程度與

16、前列腺移行帶體積明確相關(guān)。
　　 2、缺血可促進(jìn)前列腺組織內(nèi)間質(zhì)及上皮細(xì)胞增殖,抑制其凋亡并最終導(dǎo)致前列腺重量增加,且這些變化與缺血時(shí)間相關(guān)；缺血首先引起前列腺組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生改變。缺血可加重梗阻情況下膀胱逼尿肌功能損害,同時(shí)降低膀胱逼尿肌功能代償能力,加速膀胱組織內(nèi)神經(jīng)元損害過程。
　　 3、缺氧可誘導(dǎo)前列腺間質(zhì)及上皮細(xì)胞內(nèi)生長因子受體及雌雄激素受體的表達(dá),促進(jìn)前列腺間質(zhì)細(xì)胞分泌多種生長因子。缺氧條件培養(yǎng)基和缺氧環(huán)境