miR-204在前列腺增生中的表達(dá)和功能研究.pdf

1、第一部分 miR-204在前列腺增生中的表達(dá)和功能研究
　　良性前列腺增生癥(BPH)是老年男性常見病，由于它在泌尿系統(tǒng)所造成的梗阻，影響排尿，直接威脅腎功能，給患者的生活與健康帶來嚴(yán)重的危害，一直是國際上研究的重要課題之一。前列腺增生的發(fā)病機(jī)制至今仍不明了，但臨床研究與基礎(chǔ)研究都表明雄激素及其下游信號(hào)通路在前列腺增生中具有關(guān)鍵作用。miRNA是一組廣泛存在于真核生物中，不編碼蛋白質(zhì)的長約20-24nt的小RNA分子，可通過與靶基

2、因的3'UTR完全或不完全匹配，降解靶基因或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)。我們實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道在前列腺癌LNCap細(xì)胞中miR-204的表達(dá)水平受雄激素的下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-204與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。鑒于我們課題組在前列腺癌中miR-204的表達(dá)和功能研究中取得的一定成果，我們推測(cè)在同樣受雄激素調(diào)控的前列腺增生的組織中，miR-204作為雄激素調(diào)控的下游基因參與了前列腺增生的發(fā)生和發(fā)展。我們成功

3、誘導(dǎo)了大鼠前列腺增生模型，并發(fā)現(xiàn)在雄激素水平逐漸增高的情況下，miR-204的表達(dá)水平降低。同時(shí)設(shè)置了去勢(shì)模型和氟他胺干預(yù)前列腺增生模型，在這兩種模型中，發(fā)現(xiàn)miR-204的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了miR-204的表達(dá)水平受雄激素的負(fù)調(diào)控。同時(shí)，我們檢測(cè)了miR-204的前體pre-miR-204、宿主基因TRPM3的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)二者在不同模型里的變化趨勢(shì)與miR-204有相對(duì)平行關(guān)系。進(jìn)一步我們運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)

4、測(cè)miR-204的下游靶基因，在綜合三種靶基因預(yù)測(cè)軟件和國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上初步預(yù)測(cè)了FOXC1、PDEF、XRN1三種靶基因。結(jié)果顯示，在miR-204表達(dá)水平逐漸升高的去勢(shì)模型和氟他胺干預(yù)模型中，XRN1mRNA的表達(dá)含量逐漸降低;在miR-204表達(dá)水平逐漸降低的前列腺增生模型中XRN1的表達(dá)含量逐漸增高，而預(yù)測(cè)的其他靶基因表達(dá)水平變化無規(guī)律。進(jìn)一步從蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在去勢(shì)模型和氟他胺干預(yù)模型中，XRN1蛋白含量有所降

5、低，而在前列腺增生模型中，XRN1蛋白含量隨著增生程度的加深有所增加。XRN1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化結(jié)果充分證明了XRN1是miR-204的靶基因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-204可作為雄激素的下游調(diào)節(jié)基因，參與到前列腺增生的發(fā)生、發(fā)展過程中。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索雄激素受體通過miR-204調(diào)控前列腺增生的機(jī)理。
　　第二部分人類HMGB4蛋白的表達(dá)純化和多克隆抗體的制備
　　高遷移率蛋白族(high mob

6、ility group，HMG) HMG蛋白，是真核細(xì)胞內(nèi)繼組蛋白之后含量最為豐富的一組染色質(zhì)蛋白質(zhì)。研究表明HMG家族兼有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的功能和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能。根據(jù)分子量大小、序列相似性和DNA結(jié)構(gòu)特性，HMG可進(jìn)一步分為HMGB、HMGA、HMGN3個(gè)家族。HMGB4是HMGB家族的一個(gè)新成員，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展了關(guān)于HMGB4的前期研究工作，初步的結(jié)果表明HMGB4是一種核仁蛋白，其表達(dá)具有相當(dāng)高的睪丸組織特異性。本研究的目的

7、是制備人HMGB4的多克隆抗體，以方便后續(xù)用多種手段研究其功能。實(shí)驗(yàn)中用PCR方法擴(kuò)增人HMGB4的cDNA片段，克隆于融合蛋白表達(dá)載體pET-28a(+)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化、質(zhì)譜鑒定后，成功表達(dá)了相對(duì)分子量為28000的人HMGB4融合蛋白。重組人HMGB4蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備兔抗血清。抗血清經(jīng)純化后經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1∶102400; Western blot、免疫