磁性葡聚糖-絲裂霉素前體藥物納米粒的研制.pdf

1、研究背景和目的 20世紀(jì)70年代以來，藥物制劑的發(fā)展已經(jīng)向第四代制劑——靶向制劑的研究邁進，對于抗腫瘤藥物研制，靶向制劑有其本身固有的優(yōu)越性，即可以大大減少化療毒性藥物對非靶器官的毒性，從而保證藥物能夠濃集于靶向組織。肝臟是人體少數(shù)幾個實質(zhì)細胞與血液直接相通的器官之一。多數(shù)哺乳動物內(nèi)皮窗無隔膜，可以說它是通透性最大的血管之一，大分子物質(zhì)可以自由通過，血液中的脂肪分解物(小乳糜粒)也可以進入，極低密度脂蛋白可通過竇壁進入血液，因此

2、在血液和肝細胞之間均無嚴(yán)密的屏障結(jié)構(gòu)。所以，肝細胞是藥物給藥系統(tǒng)理想的靶部位之一。近年由于靶向藥物載體研究的飛速發(fā)展，這方面已取得了長足的進展。如利用載藥納米粒固有的被動肝靶向性特點將藥物導(dǎo)向肝區(qū)，對于主動靶向制劑如磁性載藥納米粒則可通過在右上腹施加外磁場，將藥物引導(dǎo)至肝區(qū)，可有效提高藥物的靶向效率，因而也比較適合于肝靶向。也可將高分子載體材料與藥物結(jié)合生成的新的前體藥物，其中高分子載體材料作為藥物儲庫，在體內(nèi)前體藥物可通過肝固有的微粒

3、體酶系統(tǒng)使藥物可以重新釋放出來而發(fā)揮其治療作用。而如果將前體藥物和納米磁性材料相結(jié)合，將得到磁性前體藥物納米制劑，則能綜合前體藥物、磁性以及納米載體的優(yōu)點而發(fā)揮作用。 主要內(nèi)容 本研究用堿性化處理的葡聚糖包裹以Fe3O4為母核的磁流體，形成磁性葡聚糖納米粒，并在磁性葡聚糖納米粒表面鏈接6個碳原子的有機鏈，使之能夠在空間位阻較大的情況下與絲裂霉素C順利鏈接，生成磁性葡聚糖-絲裂霉素前體藥物納米粒，并對其進行了體外釋藥實驗、

4、急性毒性實驗、以及體內(nèi)分布肝靶向性實驗和裸鼠藥效學(xué)觀察研究。磁性前體藥物的設(shè)計和提出是一種新的思路。 論文首先利用化學(xué)沉淀法制備了Fe3O4納米粒，并利用均勻設(shè)計考察了溫度、pH值等實驗條件對制備的影響，得到了顆粒微小、分散均勻的Fe3O4納米粒。實驗表明單純的Fe3O4納米粒膠體具有物理化學(xué)不穩(wěn)定性。其中Fe3O4含量利用紫外分光分光光度法測定Fe的含量，然后將其折算為Fe3O4而得。磁性葡聚糖納米粒是將葡聚糖在強堿性條件下進

5、行堿性化處理，用堿性化葡聚糖(AD)包覆Fe3O4得到的葡聚糖磁流體，其粒徑為50nm左右，室溫放置超過一年無顯著外觀變化，對其在一定的酸堿條件下進行考察，發(fā)現(xiàn)其具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，紅外光譜考察顯示，堿性化葡聚糖和Fe3O4之間發(fā)生了一定的作用。 實驗的第二個關(guān)鍵部分在于磁性葡聚糖外懸臂的鏈接，將磁性葡聚糖在強堿性條件下，與含6個碳的六溴己酸進行化學(xué)鏈接，是本實驗的創(chuàng)新點之一，未見相關(guān)文獻報導(dǎo)。最終得到的具懸臂的磁性葡聚糖(D

6、MS)溶液室溫放置5個月以上未見明顯的外觀變化，因而適合進一步鏈接藥物，對其進行飽和磁化強度測定發(fā)現(xiàn)，一定濃度下的DMS溶液飽和磁化強度Os為0.60emu/mL。 論文的第三章通過正交設(shè)計實驗得到了具懸臂的磁性葡聚糖與MMC在EDC存在條件下，最高接枝率和載藥量的實驗條件。最終得到磁性葡聚糖-絲裂霉素前體藥物納米粒，并探討了其基本形成機理。其中，MMC的含量利用葡聚糖-75柱分離紫外分光光度法測定，磁流體含量利用火焰原子吸收分

7、光光度法測定。結(jié)果表明，在最佳工藝條件下，冷凍干燥樣品的接枝率可以達到89.9％，載藥量可達到8.53％，粒徑大小120nm左右，F(xiàn)e3O4含量達到27％(w/w)，ξ電位為-26.6mv，冷凍干燥前后，粒徑和ξ電位沒有顯著變化，其膠體溶液狀態(tài)室溫放置超過12個月未發(fā)現(xiàn)明顯的外觀變化。 磁性前體藥物在體內(nèi)發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵決定于藥物是否能夠重新完整釋放，為此，首先考察了其在體外釋藥規(guī)律，并用于預(yù)測其在體內(nèi)的釋藥規(guī)律。實驗在RCD

8、-6型藥物溶出儀上進行，取pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液為釋藥介質(zhì)，通過紫外分光光度儀上測定其不同時刻的累積釋放量，結(jié)果表明，96h時，DMSM-NP的釋放量可以超過60％，釋藥規(guī)律基本符合Weibull模型。 作為抗腫瘤藥物，為了了解NMSM-NP毒性，為臨床毒副反應(yīng)的監(jiān)測提供參考依據(jù)，需對其進行了急性毒性實驗，方法：按照等比0.7的劑量間隔分組對小鼠進行尾靜脈注射，結(jié)果表明，對照組小鼠普遍精神狀態(tài)萎靡，食欲減退，尾部從注射部

9、位以下隨著時間推移開始逐漸干燥，高劑量組死亡迅速，尸體解剖胃腸道呈現(xiàn)充氣充水狀態(tài)，其它臟器病理變化目視不明顯，提示MMC具有很強的胃腸道反應(yīng)。而實驗組注射后，除了大劑量注射后立刻出現(xiàn)的半昏厥狀態(tài)外，兩周無一死亡，而且精神狀況和正常小鼠沒有明顯差別，提示DMSM的毒性大大降低。 制備DMSM-NP肝靶向制劑，而其是否能濃集在肝，須通過體內(nèi)分布實驗來說明，選取18-22gKM鼠，將小鼠置于可調(diào)式磁場的作用環(huán)境下，固定磁軛距離為2cm

10、，尾靜脈注射，在不同的時刻眼眶取血致死，剖取肝、心、脾、肺、腎等組織器官，用HPLC法考察不同時刻不同臟器內(nèi)MMC的含量，結(jié)果顯示：在不同時刻肝的靶向率分別為：43.38％、50.38％、66.37％、62.34％、60.38％、53.22％、47.63％、37.52％，遠遠高于對照組，表明在體外磁場引導(dǎo)下，DMSM具有持久的肝靶向性，在60min時，肝臟中藥物分布百分比為最高，而且肝中其藥物在5h仍可測，隨著時間的進一步增加，藥物在腎

11、中的所占的百分比逐漸增加。從實驗組AUC、T1/2、MRT分別為43.45、3.77、5.87均遠遠大于對照組相應(yīng)的1.09、0.21和0.45，說明DMSM生物利用度明顯優(yōu)于對照組MMC針劑且緩釋效果明顯。從DMSM對MMC的靶向指數(shù)和選擇性指數(shù)看，DMSM組具有很好的肝臟器官的趨向性，在不同時刻肝靶器官和非靶器官之間的藥量有顯著性差異。同樣，從靶向效率和相對靶向效率可以看出，DMSM從總體上看在外磁場的引導(dǎo)下，具有良好的肝趨向性和緩

12、釋效果。 所制制劑的最終目的是更好地抑制腫瘤的生長，提高抑瘤率。為此，通過裸鼠皮下移植人源Bel-7402肝腫瘤細胞，建立腫瘤模型，以生理鹽水為空白、絲裂霉素注射劑為陽性對照，結(jié)果表明，所制備的制劑抑瘤率明顯高于絲裂霉素組，在體外磁場作用下，高劑量的抑瘤率達到90％，同時隨著劑量增加，抑瘤效果更好。 結(jié)論 本實驗從前體藥物和磁性相結(jié)合的角度，制備了磁性前體藥物納米粒，并顯示出了良好的物理趨向性，為磁性靶向制劑的研