神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白Alpha-synuclein和嚴(yán)重抑郁癥相關(guān)蛋白DCNP1的功能研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson disease，PD)是最常見的神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)障礙疾病，其病理上以多巴胺神經(jīng)元的丟失和黑質(zhì)致密部存活神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)包含體．路易小體(Lewy bodies，LBs)為特征，并伴有營養(yǎng)缺陷型神經(jīng)突-路易神經(jīng)突(Lewy neuritis，LNs)。雖然圍繞路易小體的研究有很多，但是對(duì)其生成的機(jī)制仍不甚清楚。Alpha-synuclein(α-syn)和泛素(Ub)是路易小體和路易神經(jīng)突的主要蛋白成分。α-SYN

2、是被鑒定的第一個(gè)PD致病基因。α-SYN基因與PD相關(guān)的三種突變促成少見的家族型PD發(fā)生。在PD、路易小體癡呆(dementia with LBs，DLB)、多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA)和青年發(fā)病的神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良(juvenile onset neuroaxonal dystrophy)中均發(fā)現(xiàn)α-syn的沉積。這些疾病被稱為synuclein病，提示α-syn可能在這些神經(jīng)退行性疾病中起共同的

3、作用。在synuclein病病人腦組織以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，α-syn的129位絲氨酸(S129)受到廣泛地選擇性地磷酸化。該磷酸化是α-syn的毒性作用的關(guān)鍵，并引導(dǎo)α-syn的泛素化。路易小體中幾乎90％的α-syn的129位絲氨酸(S129)被磷酸化，但129位絲氨酸磷酸化的α-syn在路易小體形成中的作用機(jī)制仍不清楚。我們將α-syn的129位絲氨酸突變?yōu)樘於彼針?gòu)建了模擬129位絲氨酸持久磷酸化狀態(tài)的α-syn突變體(S129D)

4、。當(dāng)和泛素共同表達(dá)于Neuro2a細(xì)胞后，相比對(duì)照載體和野生型α-syn(WT)，S129D促成更多泛素結(jié)合物，并導(dǎo)致胞質(zhì)泛素化包含體的形成。而與63位賴氨酸突變的泛素共表達(dá)時(shí)，S129D-α-svn不再促進(jìn)泛素結(jié)合物和形成泛素包含體。在去血清和雙氧水處理的neuro2a細(xì)胞中，S129D-α-syn比野生型α-syn形成更多胞質(zhì)和神經(jīng)突內(nèi)的聚集。這些結(jié)果提示129位絲氨酸磷酸化的Cc-syn可能通過促進(jìn)泛素63位賴氨酸鏈接物和自身聚集

5、的形成參與帕金森病以及其它相關(guān)疾病中路易小體的形成。 泛素嚴(yán)重抑郁(Major depression，MD)是一種常見病，它治療費(fèi)用昂貴，可反復(fù)發(fā)作。并且有較高的發(fā)病率和死亡率。人們預(yù)測(cè)，到2020年，MD將成為僅次于缺血性心臟病的全球性第二大主要疾病。許多研究表明免疫系統(tǒng)的變化與MD相互間有著密切的關(guān)聯(lián)。諸如白介素-1(interleukin-1， IL-1)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α

6、，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等炎性細(xì)胞因子水平的升高意味著免疫系統(tǒng)的激活，而免疫系統(tǒng)的激活與MD有關(guān)。由于其對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌以及MD相關(guān)行為的作用，炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為在MD的病理生理學(xué)中起重要作用。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，其最大的特點(diǎn)就是能夠刺激初始型T細(xì)胞(Naive T cel

7、ls)增殖，是機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)的啟動(dòng)者，具有調(diào)節(jié)免疫激活和免疫耐受的平衡功能，在免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，近年來被研究用于移植免疫耐受和腫瘤免疫治療。樹突狀細(xì)胞核蛋白1 (dendritic cellnuclear proteinl，DCNP1)是由244個(gè)氨基酸組成的蛋白，在成熟DCs中高表達(dá)，主要分布與腦及骨骼肌，定位于成熟DCs的核周，與DCs和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記蛋白CD68存在共同的分布。最近的研究提示DCNP1是一個(gè)MD候選基

8、因，其突變體會(huì)導(dǎo)致DCNP1蛋白在第117個(gè)氨基酸提前終止，與MD發(fā)病相關(guān)。而DCNP1參與MD發(fā)病的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。DCs的免疫調(diào)節(jié)功能是否與MD相關(guān)，DCNP1又如何參與MD都有待研究。為進(jìn)一步探索DCNP1與MD的聯(lián)系，我們自人HEK293細(xì)胞克隆了DCNP1基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。在體外，His-tag融合DCNP1(His-DCNPl)在大腸桿菌成功表達(dá)，并用于多克隆抗體制備。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，EGFP融合

9、DCNPl野生型(DCNP1-EGFP)和N端突變體DCNP1(1-116)-EGFP，C端突變體DCNP1(117-244)-EGFP以及核定位信號(hào)(NLS)缺失突變體DCNP1(RRK)-GFP均有較好表達(dá)。熒光觀察結(jié)果顯示，DCNP1-EGFP定位在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核。核定位信號(hào)<'117>RRK<'119>缺失后，DCNPl(△RRK)-EGFP在293FT細(xì)胞中呈明顯胞質(zhì)分布，而在Neuro2a細(xì)胞中呈現(xiàn)核、質(zhì)分布。DCNP1(1