功能性自組裝雙親多肽水凝膠支架聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞智能修兔骨性關(guān)節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、本文分五個部分進(jìn)行探討。
　　第一部分：新型自組裝雙親多肽水凝膠的合成
　　目的:設(shè)計和合成促進(jìn)細(xì)胞增殖和TGF-β粘附的自組裝雙親多肽水凝膠，并檢測其自組裝形成凝膠后的超微結(jié)構(gòu)。
　　方法:合成的PRG和TB多肽粉劑分別溶解于去離子水中，終濃度為1％。然后再分別稀釋成0.05％(m/v)，分別取3ul的PRG，TB及兩者等體積混合的多肽溶液。原子力顯微鏡檢測多肽的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:成功合成PRG和TB雙親多

2、肽分子,雙親多肽溶液PRG和TB混合自組裝形成凝膠。原子力顯微鏡掃描提示:PRG/TB混合水凝膠的納米纖維比PRG和TB要大，PRG，TB，PRG/TB納米纖維的平均直徑分別為(16.7±4.7nm),(18.0±1.3nm)和(28.3±5.6 nm)。
　　結(jié)論:雙親多肽PRG和TB可以混合自組裝形成納米級凝膠支架(PRG/TB),可以作為軟骨組織工程的生物支架材料。
　　第二部分：新骨性關(guān)節(jié)炎模型的研究
　　目的

3、:探討通過注射MIA的方法建立一種能模擬自然病程引起的早，中期骨性關(guān)節(jié)炎模型，用以評價組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的研究。
　　方法:40只新西蘭雄性大白兔子被隨機分為三組。麻醉后，通過關(guān)節(jié)穿刺的方法，每組膝關(guān)節(jié)右側(cè)注射100ul不同濃度的MIA（1mg/ml、3mg/ml和6mg/ml），左側(cè)膝關(guān)節(jié)注射PBS作為對照組。分別于2周，4周和6周拍膝關(guān)節(jié)X線，并用墨汁染色比較大體形態(tài)，組織病理染色觀察軟骨組織的退變。
　　結(jié)果:兔膝關(guān)

4、節(jié)1mg/ml MIA注射組關(guān)節(jié)退變不明顯，兔膝關(guān)節(jié)3mg/ml和6mg/ml MIA組病理染色評分和對照組比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但6mg/ml MIA注射組關(guān)節(jié)退變嚴(yán)重。
　　結(jié)論:通過注射3mg/mlMIA的兔膝關(guān)節(jié)可以在六周內(nèi)達(dá)到類似輕，中度骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)退變，為評價組織工程修復(fù)軟骨退變提供一個新的骨性關(guān)節(jié)炎動物模型參考。
　　第三部分：慢病毒載體融合蛋白TGF-β3和多肽水凝膠對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)影

5、響
　　目的:構(gòu)建出具有靶向治療功能的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3，并通過慢病毒載體包裝后轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs），兩者培養(yǎng)在多肽水凝膠支架內(nèi)，以驗證其可行性與靶向特異性。
　　方法：消化法分離得到兔ADSCs，通過流式法鑒定ADSCs表面抗原及特殊染色法鑒定ADSCs多向分化能力。通過基因重組方法將LAP，mTGF-β3和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的酶切位點PLGLWA分別插入到真核質(zhì)粒表

6、達(dá)載體 GV287，得到重組TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3的質(zhì)粒。用慢病毒載體包裝質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染ADSCs，并培養(yǎng)在PRG/TB多肽水凝膠內(nèi)。CCK8法檢測增殖細(xì)胞增殖，鈣黃綠素/碘化丙啶法檢測細(xì)胞在凝膠內(nèi)部的存活，Elisa法檢測MMP酶刺激后上清液中的mTGF-β3。
　　結(jié)果：成功分離培養(yǎng)出ADSCs，并且ADSCs培養(yǎng)在PRG/TB混合多肽水凝膠內(nèi)可以提高增殖。慢病毒載體及PRG/TB多肽水凝膠對ADSCs

7、的毒副作用小，并且MMP酶存在時可激活重組TGF-β3融合蛋白釋放活性的TGF-β3。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建出慢病毒載體包裝的新型融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3，慢病毒載體包裝的新型融合蛋白轉(zhuǎn)染的ADSCs與PRG/TB多肽水凝膠一起具有靶向性修復(fù)軟骨缺損的應(yīng)用前景。
　　第四部分：LV-mTGF-β3轉(zhuǎn)染的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在雙親多肽水凝膠內(nèi)誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的研究
　　目的:探討功能性自組裝 PRG/TB水凝膠支架

8、與慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）誘導(dǎo)成軟骨的影響。
　　方法：將慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染第三代ADSCs后，與功能性PRG/TB水凝膠支架共同培養(yǎng)在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液中，并增加10ng/ml基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）促進(jìn)融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3釋放TGF-β3，促進(jìn)ADSCs分化成軟骨細(xì)胞。3天后用Western blot檢測T

9、GF-β3在ADSCs中的表達(dá)。ADSCs誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞21天后，分別用Real-time PCR和Western blot檢測軟骨細(xì)胞特異性基因Aggrecan（ACAN），Ⅱ型膠原（COL2A1）和SOX-9的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:慢病毒包裝融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染ADSCs效率能達(dá)到90％以上。3天后轉(zhuǎn)染慢病毒的ADSCs成功檢測到TGF-β3的表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染融合蛋白LAP-MMP-mTGF

10、-β3的ADSCs相比，轉(zhuǎn)染組明顯促進(jìn)了ADSCs向軟骨細(xì)胞分化。21天后轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，ACAN、COL2A1和SOX-9 mRNA表達(dá)分別增加2.7，2.4和1.0倍，蛋白表達(dá)分別增加2.4，1.57和0.89倍。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建的慢病毒包裝融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染ADSCs可促進(jìn)ADSCs分化成軟骨細(xì)胞，具有很好的修復(fù)軟骨缺損的應(yīng)用前景。
　　第五部分：功能性自組裝多肽水凝膠聯(lián)合LV-mTG

11、F-β3轉(zhuǎn)染的ADSCs修復(fù)骨性關(guān)節(jié)炎的研究
　　目的:進(jìn)一步驗證PRG/TB自組裝多肽水凝膠支架聯(lián)合LV-mTGF-β3轉(zhuǎn)染的兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）在體內(nèi)修復(fù)軟骨的能力。
　　方法:將慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染ADSCs后，與功能性PRG/TB自組裝多肽水凝膠支架共同培養(yǎng)在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液中。21天后，在裸鼠背部分別種植不同組的ADSCs和多肽PRG/TB自組水凝膠混合物，觀察多肽凝膠的

12、毒副作用，4W后注射部位的組織用阿利新藍(lán)染色和免疫組化染色檢測成軟骨的能力。新西蘭大白兔用注射MIA方法完成骨性關(guān)節(jié)炎造模，然后每七天注射一次多肽水凝膠和慢病毒轉(zhuǎn)染后的ADSCs混合物到骨性關(guān)節(jié)炎模型的膝關(guān)節(jié)，注射PBS作為試驗對照組。8W后，組織染色觀察多肽水凝膠聯(lián)合重組TGF-β3蛋白轉(zhuǎn)染的ADSCs修復(fù)關(guān)節(jié)的情況。
　　結(jié)果:慢病毒包裝的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3轉(zhuǎn)染ADSCs組在裸鼠皮下生成的軟骨組織外形要大于