極低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)正常大鼠和體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷效應(yīng).pdf

1、研究目的：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，社會(huì)的進(jìn)步，電磁輻射在廣播、通信、工業(yè)、科學(xué)研究、國(guó)防、醫(yī)療衛(wèi)生等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并深入到家庭中。然而，電磁輻射也成為繼“三廢”污染之后的第四大環(huán)境污染源，嚴(yán)重影響了人體健康。因此，各類電磁場(chǎng)的生物效應(yīng)便成為生物電磁學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。 在人體各系統(tǒng)中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對(duì)電磁輻射最敏感的系統(tǒng)，神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，要深入探討脈沖磁場(chǎng)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)作用，就必須開(kāi)展脈沖磁場(chǎng)

2、對(duì)神經(jīng)元作用的研究。脈沖磁場(chǎng)對(duì)神經(jīng)元的生物學(xué)效應(yīng)是磁場(chǎng)和神經(jīng)元共同作用的結(jié)果，是與兩者的參數(shù)密切相連的。脈沖磁場(chǎng)的頻率、強(qiáng)度、作用時(shí)間，接受磁場(chǎng)作用的神經(jīng)元的來(lái)源、部位、生長(zhǎng)狀態(tài)等參數(shù)都是影響脈沖磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)的主要因素。 本課題對(duì)大鼠頭部和體外培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元施加脈沖磁場(chǎng)輻射，旨在探討極低頻(15Hz)脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶、腦組織形態(tài)學(xué)、腦電圖的影響及對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷效應(yīng)，并綜合分析其可能機(jī)制。 研

3、究方法： 1、36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)和實(shí)驗(yàn)組(B組)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠施加脈沖磁場(chǎng)輻射(重復(fù)頻率15Hz、平均場(chǎng)強(qiáng)0.1mT)，發(fā)射源固定于清醒態(tài)大鼠顱頂骨外約2mm處，45min/次，1次/d，連續(xù)30d。輻射完畢12h后，分別對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行以下檢測(cè)： (1)、Morris水迷宮測(cè)試以檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并用攝像機(jī)實(shí)時(shí)拍攝兩組大鼠的行為。 (2)、形態(tài)學(xué)觀察： ①

4、、光學(xué)顯微鏡觀察：將2組大鼠斷頭處死，在冰盒上快速開(kāi)顱取腦，取額葉皮質(zhì)腦組織，常規(guī)制備石蠟切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，進(jìn)行光鏡觀察。 ②、透射電子顯微鏡觀察：將取得的額葉波質(zhì)腦組織修成約1mm<'3>的小樣品塊若干，迅速置入3﹪戊二醛固定液中，常規(guī)方法制備超薄切片，JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察記錄。 (3)、腦電圖(EEG)檢查：以檢測(cè)兩組大鼠腦電節(jié)律的變化。 2、以Wistar孕大鼠15.5～16

5、.5d的胚胎原代培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)材料。神經(jīng)元培養(yǎng)48h后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元施加極低頻脈沖磁場(chǎng)輻射，主要參數(shù)選擇：重復(fù)頻率15Hz、平均場(chǎng)強(qiáng)0.1mT，30min/次，3次/d，共2d。輻射完畢12h后，分別對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元進(jìn)行以下檢測(cè)： (1)、檢測(cè)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化：利用透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化。 (2)、相對(duì)存活率測(cè)定：四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)

6、元的相對(duì)存活率。 (3)、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca<'2+>濃度的變化：收集細(xì)胞，加Fluo3/AM至終濃度為101μmol/L，避光孵育1h。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，發(fā)射波長(zhǎng)為526nm)，取10000個(gè)神經(jīng)元熒光強(qiáng)度值的平均值為各組測(cè)定值。 (4)、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定線粒體膜電位：收集細(xì)胞，加羅丹明123至終濃度為10μg/ml，孵育30min。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波

7、長(zhǎng)為530nm)，取10000個(gè)神經(jīng)元熒光強(qiáng)度值的平均值為各組測(cè)定值。結(jié)果： 1、極低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)正常大鼠學(xué)習(xí)記憶、腦組織形態(tài)學(xué)及EEG的影響： (1)、兩組大鼠在水迷宮中游泳的情況：對(duì)照組大鼠在水迷宮中游泳姿勢(shì)協(xié)調(diào)、肌力、抖毛反射均正常。第一次輻射完畢24h后實(shí)驗(yàn)組大鼠精神萎靡，在水迷宮中游泳姿勢(shì)不協(xié)調(diào)、肌力減退，抖毛反射減弱，但是，隨著時(shí)間的推移，此現(xiàn)象逐漸消失。 (2)、Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果：對(duì)照組和

8、實(shí)驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)1d、2d、3d、4d、5d、9d、20d、29d的逃避潛伏期分別為19.4±10.0、14.1±10.0、12.7±10.1、6.6：t：3.5、6.54±3.0、6.1±2.8、7.1±2.2、6.1±16.8和55.2±32.2、17.34±9.9、13.34±9.0、8.9±3.1、7.74-2.6、6.5±1.4、7.84±10.5、7.1±7.3。 (3)、極低頻脈沖磁場(chǎng)輻射對(duì)大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響：

9、 ①、光學(xué)顯微鏡觀察：對(duì)照組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體飽滿，軸突明顯。實(shí)驗(yàn)組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞體固縮，染色質(zhì)邊集。 ②、透射電子顯微鏡觀察：對(duì)照組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核呈圓形，核仁居中，染色質(zhì)的密度和分布正常，核周體胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富。實(shí)驗(yàn)組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變。 (4)、腦電圖檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組大鼠腦電圖的頻率和波幅分別為9,67±1.37(Hz)和76.74±10.8(μm)；實(shí)驗(yàn)組大鼠腦電圖的頻率和波幅分別為

10、7.71±1.12(Hz)和58.9±8.6(μm)。 2、極低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷效應(yīng)： (1)、形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)照組神經(jīng)元，倒置顯微鏡下所見(jiàn)：分散均勻，胞體飽滿立體感強(qiáng)，呈三角形或多角形，細(xì)胞之間建立突起聯(lián)系，胞體及突起表面平滑。電鏡下，神經(jīng)元雙層核膜清晰光滑，常染色質(zhì)豐富，核周體胞漿中線粒體較多，其雙層膜和嵴清晰。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元，倒置顯微鏡下所見(jiàn)：生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳，胞體欠飽滿，神經(jīng)元之間也有突起聯(lián)系，但

11、較對(duì)照組明顯減少，胞體和突起表面粗糙。電鏡下，神經(jīng)元胞漿內(nèi)分布有較多的髓樣體，大部分線粒體的嵴排列紊亂，局部或完全空化，可見(jiàn)數(shù)個(gè)空泡化的線粒體聚集并被單層膜包繞在一起(線粒體聚集現(xiàn)象)。 (2)、相對(duì)存活率測(cè)定：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元光密度(A<,570>)值分別為0.494±0.031和0.401+0.023。 (3)、神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca<'2+>濃度的測(cè)定：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離Ca<'2+>平均熒光強(qiáng)度分別為66.

12、69±2.24和78.22±1.59。 (4)、線粒體膜電位測(cè)定：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元線粒體膜電位平均熒光強(qiáng)度分別為69.49±1.94和41.66±2.01。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)條件下，極低頻脈沖磁場(chǎng)(重復(fù)頻率15Hz、平均場(chǎng)強(qiáng)0.1mT)長(zhǎng)時(shí)程(30d)輻射可影響大鼠的腦電節(jié)律，并可導(dǎo)致大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡及其他超微結(jié)構(gòu)改變：可抑制體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元生長(zhǎng)并可導(dǎo)致其代謝異常、胞漿內(nèi)游離Ca<'2+>濃度升高及線

13、粒體膜電位降低。 極低頻脈沖磁場(chǎng)(重復(fù)頻率15Hz、平均場(chǎng)強(qiáng)0.1mT)長(zhǎng)時(shí)程輻射時(shí)，雖然只是在起初觀察到實(shí)驗(yàn)組大鼠明顯的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)記憶障礙，之后逐漸恢復(fù)，但腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)和腦電圖檢查都存在顯著異常改變，因此，探討極低頻脈沖磁場(chǎng)的生物學(xué)效應(yīng)需要綜合分析多項(xiàng)指標(biāo)，并應(yīng)充分考慮其長(zhǎng)時(shí)程輻射帶來(lái)的負(fù)面影響。 意義： 本課題選擇清醒態(tài)相似頻率(15Hz)作用于成年大鼠頭部和體外培養(yǎng)的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，揭示了極低頻脈沖磁場(chǎng)長(zhǎng)