抗真菌藥物Pneumocandins菌種選育以及發(fā)酵工藝研究.pdf

1、第一部分：穩(wěn)定的菌株體系的建立。菌種保存時(shí)間過長或進(jìn)行多次傳代后，往往會(huì)出現(xiàn)菌種退化現(xiàn)象。菌種退化會(huì)造成孢子形成能力減弱、孢子量減少，對外界不良條件的抵抗力下降，生產(chǎn)能力下降等。在整個(gè)研究過程中，篩選高產(chǎn)菌株和防止菌種衰退是工作的重點(diǎn)之一。
　　 目的：對我公司自主分離出來的一支Pneumocandin Bo菌株進(jìn)行自然分離（純種分離），以驗(yàn)證其原有生產(chǎn)能力。然后，對所分離的菌株采用多種方法進(jìn)行誘變處理，篩選高產(chǎn)菌株。最后，用適

2、當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行保存，以保持遺傳性狀和生產(chǎn)能力的穩(wěn)定。
　　 方法：通過自然分離、紫外誘變、微波誘變、紫外復(fù)合He-Ne激光照射、紫外復(fù)合重鉻酸鈉、微波復(fù)合制霉菌素、原生質(zhì)體法等對Pneumocandin B0菌株進(jìn)行誘變處理，篩選高產(chǎn)菌株。將篩選得到的高產(chǎn)菌株用甘油管保藏。
　　 結(jié)果：通過自然分離和上述各種方法誘變處理的綜合應(yīng)用，進(jìn)行反復(fù)大量的篩選工作，得到的Pneumocandin Bo菌株P(guān)B-36-17。該菌株經(jīng)搖

3、瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，經(jīng)HPLC效價(jià)測定，大大地高于原始出發(fā)菌株，達(dá)到了預(yù)期效果。由此充分說明了大量的自然分離和誘變處理的可行性和實(shí)用性。
　　 菌種保藏是使菌種處于休眠狀態(tài)，停止代謝，以保持菌種長久存活和穩(wěn)定，避免遺傳變異和生產(chǎn)能力下降。保藏本Pneumocandin Bo菌株最方便、最經(jīng)濟(jì)的方法是甘油管保藏。
　　 第二部分：種子培養(yǎng)條件的研究。種子由母瓶到子瓶傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要是為以后罐上發(fā)酵作準(zhǔn)備。傳代培養(yǎng)的目的是用較少的

4、斜面提供更大數(shù)量的代謝旺盛的種子，同時(shí)也可以減少斜面種子的使用量，減輕種子制備的壓力。
　　 目的：種子質(zhì)量的好壞對發(fā)酵單位的影響很大。本章主要研究了種子生長過程中菌體形態(tài)的變化，確定了種子的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基成分，并對種子的擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行了探討。
　　 方法：通過對適用于Pneumocandin Bo菌株生長的碳源、氮源按照四因素三水平正交表的配比進(jìn)行了考察；對種子傳代培養(yǎng)條件、母瓶的培養(yǎng)、子瓶的培養(yǎng)、發(fā)酵的條件等進(jìn)行單因

5、素多條件的考察。
　　 結(jié)果：確定了種子培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基為，可溶性淀粉1.5％，蛋白胨0.3％，棉籽餅粉1％，葡萄糖0.1％，磷酸二氫鉀0.05％，玉米漿1.5％，碳酸鈣0.7％，pH為自然值。一般種齡44h最佳，當(dāng)進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，接種量10％，一代種子培養(yǎng)時(shí)間為42h，二代種子培養(yǎng)時(shí)間為20h是最優(yōu)的種子控制條件。
　　 第三部分：發(fā)酵條件的研究。發(fā)酵條件的控制是直接影響到生產(chǎn)水平的重要因素。培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵溫度

6、和pH都會(huì)對生產(chǎn)水平造成極大的影響。而對于棘白霉素Pneumocandin Bo菌株來說，培養(yǎng)基成分還可能會(huì)影響到產(chǎn)品的組分，直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量。
　　 目的：優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，確定溫度、pH和接種量等發(fā)酵條件，使高產(chǎn)菌株生產(chǎn)能力得以體現(xiàn)。
　　 方法：應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分，并應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化；對培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、搖瓶裝量、接種量、菌絲濃度等——考察確認(rèn)；高產(chǎn)菌株上罐試驗(yàn)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基、攪拌

7、、氨氮等一系列條件。
　　 結(jié)果：獲得了發(fā)酵的優(yōu)化條件，培養(yǎng)基成分為甘露醇5％，葡萄糖1.5％，棉籽餅粉4％，蛋白胨0.5％，磷酸二氫鉀0.01％，硫酸鎂0.1％，脯氨酸10mg/L，pH為5.6;發(fā)酵溫度為25℃，搖瓶裝量40mL，接種量10％，發(fā)酵周期為180h。在此優(yōu)化條件下，搖瓶最后發(fā)酵單位可達(dá)到1300U/mL左右。確定了上罐條件，在實(shí)驗(yàn)罐上驗(yàn)證了該菌株的生產(chǎn)能力。
　　 結(jié)論：Pneumocandin Bo菌