抗帕金森病新藥的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià).pdf

1、帕金森病是一種錐體外系功能障礙引起的慢性神經(jīng)退行性疾病，病理特征是腦黑質(zhì)致密體部位多巴胺能神經(jīng)元變性，紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)含量顯著減少，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)功能低下而膽堿能神經(jīng)功能相對(duì)占優(yōu)勢(shì)，從而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙。帕金森氏病在60歲以上的人群中的發(fā)病率高達(dá)1％。導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性的原因迄今不明，目前認(rèn)為，遺傳、感染、免疫功能異常、衰老、體內(nèi)外的神經(jīng)毒素等因素對(duì)帕金森氏病發(fā)病均起一定的作用，而氧化應(yīng)激和線粒體功能受損在帕金森氏病的發(fā)病中

2、有十分重要的作用。 目前已有的抗帕金森病藥物只起改善癥狀的作用，不能延緩疾病的進(jìn)程，不能預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元的退變，且長(zhǎng)期應(yīng)用有嚴(yán)重的毒副作用，而且可能惡化疾病，因此急需有效的治療藥物。近年來(lái)，帕金森氏病藥物治療由直接補(bǔ)充多巴胺轉(zhuǎn)向多環(huán)節(jié)治療，重點(diǎn)集中于對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。 第一章：抗帕金森病新藥篩選根據(jù)帕金森病的發(fā)病原因和病理機(jī)制 本實(shí)驗(yàn)建立了氧化應(yīng)激相關(guān)的6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)模型和類(lèi)神

3、經(jīng)生長(zhǎng)因子的小分子活性化合物的篩選模型，這兩個(gè)模型分別從不同的作用機(jī)制來(lái)反應(yīng)藥物的作用。6-OHDA是一種選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元的毒素，此模型可以特異性的篩選出對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用的藥物。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是目前帕金森病最有效的神經(jīng)保護(hù)治療劑，但由于其蛋白質(zhì)性質(zhì)，限制了臨床應(yīng)用，此模型可以特異性的篩選出類(lèi)NGF的小分子化合物。通過(guò)對(duì)560個(gè)黃酮類(lèi)天然產(chǎn)物的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了三個(gè)同時(shí)具有較強(qiáng)的抗6-OHDA損傷和促PC12細(xì)胞分化作用的化

4、合物。本實(shí)驗(yàn)選取在這兩個(gè)模型中活性均最強(qiáng)的化合物DL0705進(jìn)行下一步的研究。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物DL0705能劑量依賴(lài)性的減輕6-OHDA致SH-SY5Y細(xì)胞的活力下降，減輕6-OHDA致SH-SY5Y的凋亡；能劑量依賴(lài)性的減輕6-OHDA致PC12細(xì)胞損傷的作用，并有明顯的促進(jìn)正常和6-OHDA損傷情況下PC12細(xì)胞分化和軸突生長(zhǎng)的作用。 DL0705的主要成分是黃芩素。黃芩素(黃芩苷元，Baicalein)是從唇

5、形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成分之一，具有多種藥理作用，如：抗菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、清除氧自由基、抗腫瘤、抗凝、抗血栓形成和保護(hù)肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用。最近的研究報(bào)道黃芩素可以預(yù)防Aβ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的損傷，可以預(yù)防6-OHDA和LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的損傷。這些研究結(jié)果提示黃芩素可能是一個(gè)有效的治療神經(jīng)退行性疾病的化合物，為了探討DL0705在帕金森病中的應(yīng)用前景，本研究進(jìn)一步采用三種不同的帕金森病動(dòng)物模

6、型，從動(dòng)物行為學(xué)、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量、多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目、氧化損傷等方面，對(duì)DL0705作為神經(jīng)元保護(hù)藥物用于抗實(shí)驗(yàn)性帕金森病的作用及機(jī)制進(jìn)行探討。 第二章：DL0705對(duì)小鼠MPTP帕金森病模型的作用及機(jī)制研究 本章采用C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP建立亞急性帕金森病動(dòng)物模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠的行為學(xué)特征，黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目和紋狀體中的單胺類(lèi)遞質(zhì)的變化來(lái)評(píng)價(jià)DL0705對(duì)帕金森病小鼠的影響，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)氨基酸類(lèi)神經(jīng)

7、遞質(zhì)，MPTP損傷通路中的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)，膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)，單胺氧化酶(MAO-B)，乙酰膽堿酯酶(AchE)和氧化應(yīng)激等多種相關(guān)指標(biāo)來(lái)探討DL0705可能的作用機(jī)制。 結(jié)果顯示，DL0705可顯著改善MPTP所致的小鼠自發(fā)活動(dòng)下降(P＜0.05)，縮短MPTP所致的小鼠爬桿時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05)；DL0705可顯著預(yù)防MPTP所致的多巴胺類(lèi)遞質(zhì)DA和HVA下降(P＜0.01)，預(yù)防5-羥色胺和腎上腺素類(lèi)遞

8、質(zhì)含量下降(P＜0.05)，而對(duì)氨基酸類(lèi)遞質(zhì)的影響不大(P＞0.05)；DL0705可使TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)目增加20％左右；DL0705可抑制炎癥反應(yīng)，如顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生(P＜0.01)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，如顯著降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平(P＜0.05)，增強(qiáng)腦組織中抗氧化酶GSH-Px的活性(P＜0.05)，可顯著降低一氧化氮水平(P＜0.05)，有降低MPO活性的趨勢(shì)，從而起到保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。比較DL

9、0705和美多芭在此模型中的作用，結(jié)果顯示DL0705與美多芭作用特點(diǎn)不同，DL0705不僅對(duì)多巴胺類(lèi)遞質(zhì)產(chǎn)生影響，而且對(duì)5-HT和腎上腺素類(lèi)遞質(zhì)也產(chǎn)生影響；除此之外，DL0705的抗氧化作用也在帕金森病中起了重要的作用。 第三章：DL0705對(duì)6-OHDA偏側(cè)損傷致帕金森病大鼠模型的作用及機(jī)制研究 本章采用6-OHDA前腦內(nèi)側(cè)束兩點(diǎn)定位注射法建立偏側(cè)帕金森病大鼠模型，造模后2周，通過(guò)檢測(cè)阿樸嗎啡誘導(dǎo)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為，選取

10、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥240轉(zhuǎn)/40min的大鼠作為造模成功的大鼠。然后隨機(jī)分組進(jìn)行藥物治療，分別在給藥后1周、2周和3周檢測(cè)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，在給藥3周后同時(shí)進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)和肌電測(cè)定，通過(guò)單胺類(lèi)遞質(zhì)的變化和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目多少來(lái)評(píng)價(jià)DL0705在體內(nèi)的活性和藥效。然后通過(guò)檢測(cè)氨基酸類(lèi)遞質(zhì)含量，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)，膠質(zhì)源性纖維蛋白(GFAP)，單胺氧化酶(MAO-B)，乙酰膽堿酯酶(AchE)和氧化應(yīng)激等多種相關(guān)指標(biāo)來(lái)探討DL0705可能作用的機(jī)

11、制。 結(jié)果顯示，造模兩周后，絕大多數(shù)大鼠出現(xiàn)了阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為，但只有60％的動(dòng)物模型成功(≥240r/40min)。而DL0705給藥3周并未降低阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)(P＞0.05)，對(duì)自發(fā)活動(dòng)雖有一定的改善作用，也未達(dá)顯著性差異(P＞0.05)。但DL0705可顯著改善帕金森病大鼠的肌電活動(dòng)，降低震顫的頻率和幅度(P＜0.01)。6-OHDA使紋狀體的多巴胺類(lèi)遞質(zhì)降低了98％以上，由于損傷嚴(yán)重，DL0705雖然對(duì)多巴胺類(lèi)

12、遞質(zhì)雖然有一定的改善作用，但均未達(dá)顯著性差異(P＞0.05)。6-OHDA使黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目降低了95％以上，因此，DL0705也未顯示出其顯著的保護(hù)作用(P＞0.05)。但總的結(jié)果表明，DL0705還是對(duì)帕金森病有一定的改善趨勢(shì)，其主要作用可能與有增加單胺類(lèi)遞質(zhì)如DA、HVA和5-HT水平的趨勢(shì)，可抑制氧化應(yīng)激，如可顯著抑制脂質(zhì)過(guò)氧化水平(P＜0.05)，顯著增加抗氧化酶GSH-Px水平(P＜0.01)，有降低MPO活性的趨

13、勢(shì)，顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生(P＜0.01)有關(guān)，但這些仍然不能很好的解釋其對(duì)肌電的改善作用。根據(jù)肌電產(chǎn)生的病理機(jī)制，除DL0705對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用可減輕震顫外，也不排除外周的作用參與。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了DL0705對(duì)外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DL0705對(duì)外周神經(jīng)傳導(dǎo)速度有一定的抑制作用。 第四章：DL0705對(duì)氧化震顫素致小鼠震顫的作用研究 多巴胺和膽堿能系統(tǒng)的失衡是帕金森病的一個(gè)重要的病理機(jī)制

14、。為了考察DL0705對(duì)膽堿系統(tǒng)的作用，本章采用小鼠腹腔注射氧化震顫素建立小鼠震顫模型，通過(guò)檢測(cè)小鼠的肌肉震顫和腺體分泌情況來(lái)評(píng)價(jià)DL0705對(duì)膽堿系統(tǒng)的影響。 結(jié)果顯示，氧化震顫素可直接激動(dòng)M受體從而引起震顫。小鼠腹腔注射氧化震顫素后，肌肉震顫明顯可見(jiàn)，全身腺體分泌增加(P＜0.05)，而未見(jiàn)DL0705對(duì)震顫程度的抑制作用(P＞0.05)，也未見(jiàn)其抑制腺體分泌的作用(P＞0.05)。結(jié)合前兩個(gè)模型，DL0705對(duì)乙酰膽堿酯酶

15、活性無(wú)影響的結(jié)果，因此，膽堿系統(tǒng)并不是DL0705作用的主要靶系統(tǒng)，但還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。 第五章：黃酮類(lèi)化合物及其組合抗帕金森病作用比較及機(jī)制探討 總結(jié)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)DL0705的抗炎和抗氧化作用在帕金森病中發(fā)揮了重要的作用，而抗炎和抗氧化作用是黃酮類(lèi)化合物的共同特性。本章旨在探討DL0705的抗帕金森病作用是其特有的作用還是結(jié)構(gòu)相似的黃酮類(lèi)物質(zhì)的一般特性?；邳S酮類(lèi)化合物抗氧化作用的構(gòu)效關(guān)系和前期高通

16、量篩選的結(jié)果，本研究選取了另外兩種化合物DL0407和DL0609，研究它們單用和合用在三種不同的帕金森病動(dòng)物模型中的作用。 結(jié)果顯示，這兩種化合物無(wú)論單用還是合用均表現(xiàn)出不同程度的抗帕金森病的作用。DL0609單獨(dú)應(yīng)用不僅強(qiáng)于DL0407和DL0705的單獨(dú)作用，而且強(qiáng)于DL0407和DL0609合用的效果，這一方面可能與其強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān)，另一方面它還對(duì)膽堿能系統(tǒng)具有一定的影響。基于相加和協(xié)同作用的理論，可以推測(cè)黃酮類(lèi)化合

17、物之間的作用可能為相加作用，可能通過(guò)相同或相似的機(jī)制起作用。因此，雖然黃酮類(lèi)化合物的抗氧化性質(zhì)非常重要，但這不可能是它們產(chǎn)生效應(yīng)的唯一解釋。綜合現(xiàn)已報(bào)道的黃酮類(lèi)化合物的中樞作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)他們主要作用于多巴胺，5-羥色胺，膽堿，腎上腺素等受體，這可能是黃酮類(lèi)化合物在抗帕金森病作用時(shí)起效較快的一種解釋?zhuān)乙部赡苁峭ㄟ^(guò)作用于受體來(lái)增加單胺類(lèi)遞質(zhì)的含量，且增加的5-HT和腎上腺素也是促進(jìn)PC12細(xì)胞分化和軸突生長(zhǎng)的一種解釋。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)一些相關(guān)