大鼠坐骨神經(jīng)損傷后背神經(jīng)節(jié)microRNA的表達(dá)變化及其功能的初步研究.pdf

1、目的：研究大鼠坐骨神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal rootganglion，DRG) microRNA(miRNA)的表達(dá)變化及其功能。
　　方法：選用健康成年雄性60-90日齡Spragu-Dawley(SD)大鼠，建立右側(cè)坐骨神經(jīng)切斷損傷模型，3天后分別提取損傷側(cè)和正常側(cè)（對(duì)照）與坐骨神經(jīng)相連的腰4-5(L4-5) DRG的總RNA，運(yùn)用miRNA芯片技術(shù)篩選損傷后表達(dá)量出現(xiàn)差異的miRNA;進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR(Qu

2、antitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和原位雜交方法對(duì)芯片差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，根據(jù)芯片及qRT-PCR結(jié)果對(duì)篩選的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè);根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建表達(dá)載體運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)候選miRNA的靶基因進(jìn)行確認(rèn)。最后，在培養(yǎng)的大鼠DRG感覺神經(jīng)元，轉(zhuǎn)染篩選獲得的目的miRNA，運(yùn)用β-tubulinⅢ免疫熒光組織化學(xué)染色觀察其

3、對(duì)神經(jīng)元神經(jīng)突長(zhǎng)度的影響、Western blotting觀察其對(duì)Robo2蛋白表達(dá)的影響研究其功能。
　　結(jié)果：MiRNA芯片結(jié)果顯示坐骨神經(jīng)切斷后，DRG內(nèi)有21種miRNA的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。qRT-PCR及原位雜交結(jié)果均顯示miR-144、miR-145和miR-214的表達(dá)均下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示Robo2和srGAP1的3'-非翻譯區(qū)(3'-untranslated regions，3'-UTR)存在mi

4、R-144、miR-145和miR-214的結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示miR-145和miR-214能分別抑制Robo2和srGAP1的表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示培養(yǎng)的DRG感覺神經(jīng)元經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-145后，Robo2的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，確認(rèn)其是miR-145的靶基因，并且神經(jīng)突長(zhǎng)度縮短，證實(shí)miR-145調(diào)控DRG感覺神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：坐骨神經(jīng)損傷后DRG神經(jīng)元miRNA發(fā)生差異表達(dá)