人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)體系的研究.pdf

1、目的：口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是發(fā)生于口腔黏膜的一種常見的慢性非感染性炎性免疫反應性疾病，該病頑固難治，反復遷延，世界衛(wèi)生組織將其列為癌前狀態(tài)。OLP致病機制復雜，尚無明確定論，近年來很多研究表明：細胞凋亡抑制是OLP的重要致病因素之一。值得關(guān)注的是核因子KB(nuclear factor kappaB，NF-kB)，它的表達、活化及易位已成為研究自身免疫相關(guān)性疾病、各類炎性疾患及腫瘤的新焦點，NF-

2、k B能夠抑制細胞的凋亡，它在OLP的發(fā)生、發(fā)展等方面具有重要調(diào)控作用，提示我們：抑制NF-k B活化的信號傳導途徑將成為OLP臨床治療的新靶點。目前，OLP的治療尚無特異性藥物，其藥物研究受到諸多因素的影響，缺乏合適的藥物評價模型是OLP藥物研發(fā)的主要障礙。本實驗從臨床病例出發(fā)，建立體外穩(wěn)定可重復的人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)體系，探討人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)方法和生物學特性，并初步研究核因子k B在培養(yǎng)人OLP角質(zhì)形

3、成細胞中的表達和定位，為今后建立基于NF-k B信號通路藥物篩選OLP體外細胞模型的實驗奠定基礎。 方法：選擇臨床及WHO標準病理確診的口腔扁平苔蘚患者黏膜活檢標本，行OLP角質(zhì)形成細胞的體外培養(yǎng)和生物學特性的研究。 1．細胞培養(yǎng)：采用冷酶消化法分離細胞，無血清培養(yǎng)基進行原代及傳代培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察和記錄細胞形態(tài)變化。cck-8法測定細胞的生長曲線，研究此細胞體外生長的增殖情況。 2．細胞鑒定：間接免疫熒光法

4、進行上皮細胞角蛋白的定性實驗，并設立陰性對照、陽性對照及空白對照組。掃描電鏡和透射電鏡從超微結(jié)構(gòu)層面進一步鑒定細胞特性。 3．核因子k B在培養(yǎng)人口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞中的表達和定位的初步測定：采用間接免疫熒光法，單克隆NF-k Bp65抗體對扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞中活化的NF-kB進行標記，明確NF-k B的表達和定位。 結(jié)果： 1．Ⅰ型OLP(網(wǎng)狀、斑塊型)角質(zhì)形成細胞可在無血清培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，可連續(xù)傳

5、5～6代，整個細胞生長期間為單一的角質(zhì)形成細胞，細胞為多角形，長到一定密度呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，符合上皮細胞生長形態(tài)特征。OLP角質(zhì)形成細胞的生長曲線基本呈“S”型，傳代周期約6～7d，一般7d左右能達90％以上融合。Ⅱ型OLP(萎縮、糜爛型)角質(zhì)形成細胞活力欠佳，不易生長，其培養(yǎng)條件需要進一步摸索。 2．角蛋白間接免疫熒光反應陽性，即角蛋白陽性表達，陽性率達到90％以上，定位于胞漿，能夠鑒定培養(yǎng)細胞為角質(zhì)成細胞。掃描電鏡顯示：細

6、胞周邊微絨毛呈輻射狀，長短不一；細胞中央凸起為胞核部位，表面呈現(xiàn)白色高密度區(qū)域，此區(qū)域為微絨毛豐富聚集，微絨毛是上皮細胞的特征性結(jié)構(gòu)之一。透射電鏡顯示：細胞胞漿內(nèi)可見大量的空泡性結(jié)構(gòu)，部分空泡內(nèi)有吞飲細胞器后的膜性結(jié)構(gòu)，這一病理性變化與OLP組織的特征性超微結(jié)構(gòu)變化相一致，能夠進一步鑒定我們培養(yǎng)的細胞為OLP角質(zhì)形成細胞。 3．OLP角質(zhì)形成細胞中部分細胞NF-k Bp65陽性表達，定位于胞核，表明體外培養(yǎng)的OLP角質(zhì)形成細胞存

7、在NF-k Bp65的活化，陽性對照組OLP黏膜上皮基底層及棘細胞層NF-kBp65陽性表達，同時固有層浸潤淋巴細胞亦見彌漫陽性表達，陰性對照組正常黏膜僅偶見基底層細胞及固有層淋巴細胞散在陽性表達。結(jié)果表明：體外培養(yǎng)的OLP角質(zhì)形成細胞保持了OLP病損區(qū)的病理表現(xiàn)特點之一即NF-k B的活化。 結(jié)論：選擇臨床診斷和病理診斷一致的Ⅰ型OLP(網(wǎng)狀、斑塊型)標本，采取Dispase冷酶消化法獲取細胞，無血清角化細胞培養(yǎng)基對OLP角質(zhì)

8、形成細胞進行原代和傳代培養(yǎng)，可傳5～6代。細胞形態(tài)學觀察顯示，細胞呈多角形，生長到一定密度呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，符合上皮細胞生長形態(tài)特征。通過超微結(jié)構(gòu)觀察及角蛋白間接免疫熒光法等細胞定性研究表明，培養(yǎng)細胞具有OLP上皮細胞的典型特征。間接免疫熒光對核因子k B在口腔扁平苔蘚角質(zhì)形成細胞中的表達和定位的初步測定表明，此培養(yǎng)體系保持了扁平苔蘚病損區(qū)的部分病理特性，能夠代表此疾病的部分特征，當然，為了使OLP角質(zhì)形成細胞更好的具有疾病模型的代表