瘤胃硝酸鹽偶聯(lián)型厭氧甲烷氧化菌及NC10門(mén)多樣性研究.pdf

1、反芻動(dòng)物CH4排放會(huì)造成能量損失和溫室效應(yīng)，硝酸鹽可有效降低CH4排放，同時(shí)為反芻動(dòng)物提供氮源。目前認(rèn)為，其降低甲烷排放的機(jī)制是其代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽對(duì)產(chǎn)甲烷菌的抑制作用，以及其消耗氫因而減少了產(chǎn)甲烷菌的底物。本研究推測(cè)瘤胃中可能同時(shí)存在甲烷厭氧氧化偶聯(lián)反硝化(DAMO)細(xì)菌、DAMO古菌和氨基氧化菌，即硝酸鹽可促進(jìn)甲烷厭氧氧化從而降低了瘤胃CH4排放。本試驗(yàn)首先檢測(cè)了添加硝酸鹽和銨鹽對(duì)短期發(fā)酵甲烷排放和微生物結(jié)構(gòu)的影響，并在此基礎(chǔ)上研究以

2、甲烷為唯一碳源對(duì)瘤胃中可能存在的硝酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，揭示瘤胃中硝酸鹽及亞硝酸鹽依賴型厭氧甲烷氧化菌多樣性，為安全利用硝酸鹽降低甲烷排放提供研究基礎(chǔ)。試驗(yàn)包括三部分:
　　試驗(yàn)一添加硝酸鹽和銨鹽對(duì)體外瘤胃液培養(yǎng)體系甲烷排放及微生物結(jié)構(gòu)的影響
　　本試驗(yàn)旨在研究瘤胃液體外培養(yǎng)體系中是否存在已發(fā)現(xiàn)的DAMO相關(guān)細(xì)菌、古菌和氨基氧化菌，并分析添加硝酸鹽是否會(huì)促進(jìn)DAMO相關(guān)微生物的增殖從而降低CH4排放。試驗(yàn)分別

3、添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4C1以及兩者混合添加對(duì)瘤胃短期發(fā)酵氣體體積、CH4總產(chǎn)量、發(fā)酵參數(shù)、硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度、干物質(zhì)降解率、總菌數(shù)量和產(chǎn)甲烷菌、NC10門(mén)細(xì)菌、ANME-2d古菌和氨基氧化菌相對(duì)總菌比例的影響。結(jié)果顯示:1）添加硝酸鹽、銨鹽組和混合添加對(duì)培養(yǎng)體系中pH、揮發(fā)性脂肪酸、干物質(zhì)降解率、中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率、亞硝酸鹽濃度和總菌數(shù)量均無(wú)明顯影響(P＞0.05)，均顯著提高了氨態(tài)氮濃

4、度(P＜0.05)，并顯著降低發(fā)酵氣體總產(chǎn)量(P＜0.05);2)硝酸鹽組顯著提高了發(fā)酵液中硝酸鹽的濃度(P＜0.05)，而同時(shí)添加硝酸鹽和銨鹽對(duì)發(fā)酵液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度無(wú)影響(P＞0.05);3)添加硝酸鹽和混合添加可顯著降低CH4體積以及產(chǎn)甲烷菌相對(duì)總菌的比例(P＜0.05);4)特異引物PCR檢測(cè)顯示，瘤胃中存在NC10，且添加硝酸鹽和混合添加顯著提高了NC10門(mén)相對(duì)總菌的比例(P＜0.05);5)采用ANME-2d和氨基氧

5、化菌特異引物PCR未檢測(cè)到DAMO古菌和氨基氧化菌。
　　試驗(yàn)二瘤胃液中硝酸鹽偶聯(lián)甲烷厭氧氧化菌多樣性研究
　　本試驗(yàn)利用16s rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了分別添加5mmol/LNaNO3、4mmol/LNH4Cl以及兩者混合添加對(duì)富集培養(yǎng)11個(gè)月過(guò)程中體系微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，分析了可能存在的硝酸鹽依賴型甲烷氧化菌菌屬組成，并利用同位素(13CH4)標(biāo)記方法檢測(cè)培養(yǎng)體系是否存在甲烷厭氧氧化過(guò)程。結(jié)果顯示，富集培養(yǎng)體系存在

6、甲烷厭氧氧化過(guò)程。富集培養(yǎng)過(guò)程使瘤胃液中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)擬桿菌門(mén)由56.73％最終降低到0.25-0.85％，銨鹽組厚壁菌門(mén)豐度由40.57％最終降低到2.44％，硝酸鹽、銨鹽和混合組變形菌門(mén)豐度分別由1.18％提高到89.41％、51.13％和69.41％，其中OTU1(屬于Paracoccus)和OTU2(屬于Phenylobacterium)等成為富集培養(yǎng)體系中的優(yōu)勢(shì)菌群，富集培養(yǎng)后其豐度范圍分別為0.08％-53.22％和0.1％-1

7、9.01％，并使瘤胃微生物區(qū)系的菌種數(shù)量分別降低到288、322和179個(gè);隨著富集培養(yǎng)，體系中OTU5（屬于Methanobacterium）豐度由未檢測(cè)到分別升高到5.81％(A04)、4.95％(B06)和9.1％(C09)。本次試驗(yàn)采用通用引物進(jìn)行高通量測(cè)序未檢測(cè)到瘤胃中存在NC10門(mén)和氨基氧化菌。富集培養(yǎng)體系不存在ANME-2d。
　　試驗(yàn)三16srDNA序列分析法檢測(cè)奶山羊瘤胃液中NC10的多樣性
　　試驗(yàn)一通過(guò)

8、特異引物PCR檢測(cè)到瘤胃液中存在NC10門(mén)，但試驗(yàn)二利用推薦的通用引物對(duì)原始瘤胃液及富集培養(yǎng)液中菌群進(jìn)行高通量測(cè)序卻未檢測(cè)到NC10門(mén)，說(shuō)明目前推薦的通用引物存在局限性。鑒于此，利用NC10特異引物對(duì)瘤胃液菌群進(jìn)行了16srDNA分析，以檢測(cè)瘤胃液中NC10門(mén)的組成。結(jié)果表明，瘤胃液中NC10門(mén)菌種存在多樣性，一共檢測(cè)到了8個(gè)OTU與M.oxyfera屬于同一分枝，但16s rDNA序列相似性不高于87％。
　　綜上，添加硝酸鹽可

9、促進(jìn)瘤胃液體外發(fā)酵體系中NC10門(mén)細(xì)菌的增殖，并因此降低了甲烷排放;同時(shí)添加硝酸鹽和銨鹽可加速硝酸鹽的還原和亞硝酸鹽的代謝。富集培養(yǎng)體系中存在甲烷厭氧氧化過(guò)程，富集培養(yǎng)后體系中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，這些優(yōu)勢(shì)菌中有能夠氧化甲烷和還原硝酸鹽的菌屬，推測(cè)其為瘤胃液中的硝酸鹽偶聯(lián)型厭氧甲烷氧化菌;特異引物PCR和16s rDNA高通量測(cè)序均未檢測(cè)到DAMO體系中的古菌ANME-2d。瘤胃液中存在NC10多樣性。根據(jù)富集培養(yǎng)中微生物區(qū)系組成可以推