亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化菌富集培養(yǎng)及優(yōu)化研究.pdf

1、亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)是一種新發(fā)現(xiàn)的生物反應(yīng)，它偶聯(lián)了厭氧甲烷氧化與亞硝酸鹽還原，是連接全球碳素循環(huán)及氮素循環(huán)的獨(dú)特環(huán)節(jié)。催化N-DAMO反應(yīng)的微生物是隸屬于NC10門(mén)的Candidatus Methylomirabilis oxyfera（M.oxyfera）。
　　前期研究表明，N-DAMO菌富集過(guò)程中始終伴隨著異養(yǎng)反

2、硝化菌，兩者之間的關(guān)系非常復(fù)雜，存在競(jìng)爭(zhēng)也存在互助，然而，這方面的研究卻未有報(bào)道。此外，N-DAMO研究的一個(gè)主要瓶頸是N-DAMO菌生長(zhǎng)極其緩慢，其倍增時(shí)間長(zhǎng)達(dá)14-25天，縮短富集周期迫在眉睫。已經(jīng)報(bào)道的所有N-DAMO接種物都取自淡水生境，近來(lái)，在海洋生境中也檢測(cè)到了N-DAMO菌的16S rRNA和pmoA基因序列，表明海洋生境中也存在N-DAMO菌，可能發(fā)生N-DAMO過(guò)程。本論文研究了淡水N-DAMO菌富集培養(yǎng)過(guò)程中N-DA

3、MO菌與異養(yǎng)反硝化菌的菌群演替規(guī)律，為獲得高純、高活性的N-DAMO富集培養(yǎng)物提供指導(dǎo);優(yōu)化了淡水富集培養(yǎng)基，探索了pH控制策略，提出了適合N-DAMO菌生長(zhǎng)的最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽組合及pH調(diào)控策略，縮短了N-DAMO菌的富集培養(yǎng)周期;富集培養(yǎng)了海洋N-DAMO菌，拓寬了N-DAMO菌的來(lái)源范圍。主要研究結(jié)果如下:
　　1.探明了淡水N-DAMO菌富集培養(yǎng)過(guò)程中N-DAMO菌與異養(yǎng)反硝化菌的菌群演替規(guī)律
　?、僖赞r(nóng)田水稻土為接種物成功

4、獲得了淡水N-DAMO富集培養(yǎng)物。富集培養(yǎng)歷經(jīng)600天，呈現(xiàn)三個(gè)階段:菌體水解階段、活性遲滯階段和活性提高階段。從活性遲滯階段開(kāi)始，N-DAMO反應(yīng)占主導(dǎo)地位?；钚蕴岣唠A段，N-DAMO菌的比活性呈指數(shù)增加，而異養(yǎng)反硝化菌的比活性?xún)H小幅增加，后期甚至略有下降。在N-DAMO菌富集培養(yǎng)過(guò)程中，N-DAMO菌得到了定向富集，異養(yǎng)反硝化菌被逐漸取代。
　　②在接種物中發(fā)現(xiàn)了歸屬于NC10門(mén)的新類(lèi)群即group E，其與M.oxyfera

5、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，16SrRNA基因序列相似度低于90％。富集培養(yǎng)6個(gè)月后此類(lèi)細(xì)菌消失，僅富集得到了歸屬于group A的NC10門(mén)細(xì)菌。
　　2.提出了適合N-DAMO菌生長(zhǎng)的最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽組合及pH調(diào)控策略
　?、俨捎谜辉囼?yàn)及酸堿滴定試驗(yàn)，優(yōu)化研究了目前普遍采用的培養(yǎng)基中四種無(wú)機(jī)鹽組分（CaCl2、 MgSO4、KH2PO4和KHCO3），獲得了適合N-DAMO菌生長(zhǎng)的最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽組合:0.3gL-1 CaCl2、0.2gL-1

6、MgSO4、0.3gL-1KH2PO4和0.2gL-1 KHCO3。
　?、谔岢隽丝刂芅-DAMO培養(yǎng)基pH為中性的策略，培養(yǎng)基中KHCO3的濃度為0.2gL-1時(shí)，用含有1％ CO2的混合氣體(1％ CO2，99％ Ar)對(duì)培養(yǎng)基曝氣，可方便有效地維持N-DAMO菌生長(zhǎng)所需的中性環(huán)境。
　　3.獲得了海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物并探索了富集培養(yǎng)物特性
　?、僖越冻练e物為接種物成功獲得了首個(gè)海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物。

7、富集培養(yǎng)期間，N-DAMO菌的比活性和數(shù)量均呈指數(shù)增長(zhǎng)。海洋N-DAMO菌的倍增時(shí)間為33.6-38.4天，長(zhǎng)于淡水N-DAMO菌的倍增時(shí)間（14-25天）。海洋N-DAMO菌的比細(xì)胞活性為0.15±0.07fmolCH4d-1cell-1，與淡水N-DAMO菌的比細(xì)胞活性（0.09-0.34fmolCH4d-1cell-1）相當(dāng)。
　　②探明了富集培養(yǎng)過(guò)程中N-DAMO菌的群落結(jié)構(gòu)特征。與淡水N-DAMO富集培養(yǎng)過(guò)程類(lèi)似，盡管在

8、接種物中檢測(cè)到了歸屬于group E的NC10門(mén)細(xì)菌，富集16個(gè)月后，僅得到歸屬于group A的NC10門(mén)細(xì)菌。表明歸屬于group A的NC10門(mén)細(xì)菌具有N-DAMO功能。
　?、厶剿髁嘶|(zhì)（甲烷和亞硝酸鹽）及鹽度對(duì)海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物的影響。海洋N-DAMO菌對(duì)甲烷和亞硝酸鹽的表觀親和力常數(shù)均低于淡水N-DAMO菌對(duì)甲烷和亞硝酸鹽的表觀親和力常數(shù)。此外，鹽度對(duì)海洋N-DAMO富集培養(yǎng)物影響較大，適合海洋N-DAMO菌生